紫外一可见分光光度计是在紫外一可见光区可任意选择不同波长的光来测定吸光度的仪器。紫外一可见分光光度计的商品型号很多，质量差别悬殊，基本原理相似。

一、基本结构

仪器的基本结构包括光学、机械和电学三个系统。

由光源、单色器、一系列的透(反射)镜、样品室和检测器组成光路，使光束准直，聚焦。一般以光学系统对分光光度计进行分类。

(1)光源分光光度计要求有能发射强度足够而且稳定的、具有连续光谱的光源，紫外光区和可见光区通常分别用氘灯和钨灯两种光源。光源的发光面积应该小，同时应附有聚光镜将光聚集于单色器的进光狭缝。

①钨灯作为可见光源，适用范围为350～1000nrn。钨灯发光强度与供电电压的3～4次方成正比，所以供电电压要求稳定。卤钨灯的发光强度比钨灯高。

②氘灯作为紫外光源，是一种气体放电发光的光源，发射自150～z~OOnm的连续光谱，使用范围为200～350nm。氢灯发光强度不如氘灯，现在仪器多用氘灯。气体放电发光需先激发，同时应该控制稳定的电流，所以都配有专用的电源装置。氢灯或氘灯的发射光谱中有几根原子谱线，可作为波长校正用。常用的有486．13nm(F线)和656．28nm(c线)。

(2)单色器单色器由狭缝、准直镜及色散元件等组成。聚集于进光狭缝的光，经准直镜变成平行光。投射于色散元件，色散元件的作用是使各种不同波长的混合光分解成单色光。再由准直镜将色散后各种不同波长的平行光聚集于出光狭缝面上，形成按波长排列的光谱。转动色散元件的方位，可使所需波长的光从出光狭缝分出。

①色散元件常用的色散元件有棱镜和光栅。早年仪器多用棱镜，近年多用光栅。紫外一可见光谱用的光栅一般每毫米刻有1200条条痕。它是利用复合光通过条痕狭缝反射后，产生衍射与干涉作用，使不同波长的光有不同的方向而起到色散作用。光栅的优点在于可用的波长范围比棱镜宽得多，而且色散近乎线性，即光栅色散后的光谱中，各条谱线间距离相等。

②准直镜准直镜是以狭缝为焦点的聚光镜。作用是将进入单色器的发散光变成平行光，又用聚光镜将色散后的单色平行光聚集于出光狭缝。

③狭缝狭缝宽度直接影响分光质量。狭缝过宽，单色光不纯。狭缝太窄，则光通量小，将降低灵敏度。所以狭缝宽度要恰当，一般以减小狭缝宽度时试样吸光度不再改变时的宽度为合适。

廉价或特殊用途的仪器多用固定宽度的狭缝，不能调节。光栅仪器多用单色光谱带宽度显示狭缝宽度，直接表示单色光纯度。棱镜仪器因色散不均匀，只能用狭缝实际宽度表示，单色光的纯度须经换算后才能得到。

(3)吸收池可见光区用光学玻璃吸收池，紫外光区使用石英池。用作盛空白溶液的吸收池与盛试样溶液的吸收池应互相匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。在测定吸光系数或利用吸光系数进行定量测定时，还要求吸收池有准确的厚度(光程)。

(4)检测器是一类光电换能器，是将所接收到的光信息转变成电信息的元件。常用的有光电池、光电管、光电倍增管、二极管阵列等。

目前，国产光电管有两种：紫敏光电管，为铯阴极，适用波长为200～625nm；红敏光电管，为银氧化铯阴极，适用波长为625～1000nm。如前章如述，光电倍增管原理和光电管相似，结构上的差别是在涂有光敏金属的阴极和阳极之间还有几个(一般是9个)倍增极。二极管阵列检测器(diode—aldydetector，DAD)常以光电二极管阵列(或CCD阵列，硅靶摄像管等)作为检测元件的检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。除了以上检测器件外，近年来还采用CCD、紫外(UV／DUV)增强镀膜和CMOS线性成像传感器等。

2．机械系统

机械系统主要有三种传动装置：①扫描机构通过波长扫描带动色散元件连续转动，使单色光的波长成线性变化。②转换机构在仪器进行连续波长扫描的过程中，可自动进行光栅的切换，光源的切换和适当滤光片的插入。③伺服电极的运转。

3．电学系统

电学系统包括信号放大与测量、操作功能控制和数据处理等部分。光电流输出电信号，需经放大后才能以某种方式将测定结果显示出来。电学系统主要有以下作用：

①信号放大和测量检测器输出的微弱信号，必须经过电流或电压放大处理，才能进行测量。

②操作功能控制通常利用微处理器和计算机对仪器各部分功能实行操作控制。

③数据处理，利用计算机采集数据，并进行数据处理，最后以图形、数据显示或打印结果提供永久性的记录。除较早期的仪器外，现代仪器在操作功能控制和数据处理等方面已经设计成由计算机来完成。但显示装置除用计算机外，还有检流计、微安表、电位计等电表式指示，数字电压表的数字显示等。

二、分光光度计的类型

紫外一可见分光光度计的光路系统大致可分为单光束、双光束、双波长等几种。

l.单光束分光光度计

此类仪器从光源到检测器只有一个测量光束，测量时，将参比和试样交替送人光路。它要求光源和检测器的供电电压有高的稳定性。而光源的不稳定性等会影响测量精度，故单光束仪器曾经不受欢迎，但是其光学系统简单，能量损失较双光束仪器小。

2．双光束分光光厦计

双光束光路是被普遍采用的光路，图17—11表示其光路原理。从单色器射出的单色光，用一个旋转扇面镜(又称斩光器)将它分成两束交替断续的单色光束，使之在很短的时间内分别通过空白溶液和样品溶液，再用另一同步的扇面镜将两束光交替地投射于光电倍增管，产生一个交变脉冲讯号，经过比较放大后，由显示器显示出透光率、吸光度、浓度或进行波长扫描，记录吸收光谱。扇面镜以每秒几十转至几百转的速度匀速旋转，使单色光能在很短时间内交替地通过空白与试样溶液，可以减少因光源强度不稳而引入的误差。测量中不需要移动吸收池，可在随意改变波长的同时记录所测量的光度值，便于描绘吸收光谱。这类仪器克服了单光束仪器的由于光源不稳而引起的误差，还可以方便地对被测组分在整个波段范围内做连续扫描，获得精细的吸收光谱。

3．双单色器双光束分光光度计

来自光源的光，经前置单色器色散之后，再进入主单色器分光，其主要特点是可将杂散光降得很低，保证有较高的光谱分辨率。

4．双波长分光光度计

用光束分裂器将光源发出的光，分成两束，进入各自的单色器，获得两束其波长可以任意调节的单色光，经用斩光器使两束不同的单色光，交替照射到同一个吸收池，到达同一检测器，测得在两个波长处的吸光度(或透光率)之差，利用吸光度的差值与浓度的正比关系测定含量，可以消除一些干扰和由于空白溶液吸收池不匹配所引起的误差，还可进行混浊样品和混合组分分析，以及导数光谱测定。

三、分光光度计的光学性能及校正

l_主要光学性能

(1)波长范围仪器能测量的波长范围，一般为190～900nm。

(2)波长准确度以仪器显示的波长数值与单色光的实际波长值之间的误差表示，一般可在±0．5nm范围内或更小。

(3)波长重现性是指重复使用同一波长时，单色光实际波长的变动值，此值一般是波长准确度误差的一半左右。

(4)狭缝或谱带宽单色器狭缝的作用是调控单色光的谱带宽度。棱镜分光仪器常用狭缝实际宽度表示，一般在0至2或3mm问可调。光栅分光仪器常用单色光的谱带宽表示狭缝宽度，一般在0一5nm范围内可调。有些低价仪器，狭缝是固定的，不能随意改变宽度。

(5)分辨率分辨率是说明单色器分光本领的指标，用仪器能分辨出的最接近的两谱线间的距离来表示，距离(△A)越小，分辨率越好，一般要求为0．1nm。

(6)杂散光通常以测光信号较弱的波长处(如’200或220nm，310或：340nm处)所含杂散光的强度百分比为指标。一般可不超过O．5％。现代的仪器可达到0．015％，甚至更低。

(7)测光准确度透光率测量误差一般约±O5％或更小。用吸光度测量值误差表示时，吸光度值，例如，A值为1时，误差为±0．005以内，A值为0．5时，误差在±O．003以内。

(8)测光重现性是在同样情况下重复测量的变动性。一一般为测光准确度误差范围的一半左右。

2．仪器的校正和检定

现代的仪器一般均有开机自检功能，可对波长准确度和吸光度准确度自检校正。由于温度变化对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，必要时，还应在测定前校正测定波长。常用汞灯中的较强谱线237．83、27528、313．16、365．02、435．83与576．96nm等，或用仪器中氢灯的379．79、486．13与656．28nm三条谱线或氘灯的486．02与656．|Onm谱线进行校正；钬玻璃在2794、287．5、333．7、418．5与536．2nm等波长处有尖锐吸收峰，也可作波长校正用，但因来源不同会有微小差别，使用时应注意。

吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸液(0．005moJ／L)检定，具体方法可参考《中国药典》2010年版附录。取在120屯干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0．005mo[／L硫酸溶液溶解并稀释至1000nd，在规定的波长处测定并计算吸收系数，与表17—2中的规定的吸收系数比较，相对偏差应在±1％以内。

杂散光的检查可按表17—3的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即用1cm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定其吸收度。溶剂和吸收池的吸收度，在：220～240nm范围内不得超过040，在24l～250nm范围内不得超过020，在251～300nm范围内不得超过O．10，在300nm以上时不得超过O．05。

四、分光光度计的发展

分光光度计在发展过程中一直不断地被改进，最近几年的改进主要有三个方面：

(1)光学系统的改进，不仅采用全息光栅，而且研究了消除像差技术，采用双单色器色散元件的组合，以降低杂散光，并提高光谱分辨率；扩展了吸光度的可读范围，一般可以测量3—5，负值也可读出。

(2)由于改进了扫描机构，使扫描速度明显加快，最快的可达30000nm／min。过去不太受欢迎的单光束分光光度计由于与计算机的联结，实现了全波段的自动扫描，具有较高的性能／价格比而重新受到青睐。

(3)采用光二极管阵列检测器，具有光谱响应宽，数字化扫描准确，性能比较稳定等优点。这类仪器的光路结构与通常的单光束仪器略有不同，从钨灯或氘灯发出的复合光，先通过样品吸收池后，再由光栅进行色散，色散后单色光为短聚焦，能量较强，直接为光二极管接收。这些光二极管体积很小，在一个硅片上可集中容纳400个光二极管。单色器的谱带宽度接近于各二极管的问距，每个谱带宽度的光信号由一个光二极管接受，整个阵列可覆盖200—800nm，只需0．1一Is的时间，可成为追踪化学反应和反应动力学研究的重要工具。当采用二极管阵列检测器时，仪器不再是按波长进行扫描，而是光束经分光后直接照在紧密排列的二极管阵列上，每个二极管测量光谱中的一个窄带，因而紫外光谱的测定在瞬间同时完成。这特别适合于快速、动态过程的检测，特别是作为HPLC的检测器，它具有快速测定的优点。需指出，由于二极管有一定的尺寸，并排的数目不可能太多，因此二极管阵列检测的分辨率不如分光型仪器。

随着计算机的不断普及，性能进一步提高，软件更加丰富。现在几乎所有的分光光度计都接有计算机，扩大内存容量，增加数据处理功能，提高了自动化水平。如仪器可进行性能自检，可作透光率、波长或基线校正，峰面积和变化率测定，光谱平滑处理，数据统计处理和文件存贮等。有些还可实现标度变更、光谱示踪、峰谷测量、和数轴转换等。

目前，我国大批自国外购进各种型号的中、高档分光光度计，几乎世界各国主要生产分析仪器厂商的产品都有，较多的有日本Shimadzu(岛津)、Hitachi(日立)、美国Beckman、Perkin—E1mer(PE)、VarianCary等公司。近年来，随着我国分光光度计研制和生产水平不断提高，国产的分光光度计的市场份额不断扩大，如北京普析通用等公司的分光光度计无论从技术指标参数、性能稳定性方面，还是软件人性化设计方面均不亚于进口产品，这标志着我国自己生产的分光光度计的质量已进入国际7k平。