一、细菌耐药性

自1928年英国细菌学家弗莱明发现了世界上第一种抗生素（青霉素）以来，抗生素在感染性疾病的治疗中发挥了重要作用。继青霉素之后，不断地发现和合成了多种抗菌药物，如青霉素之外的β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、糖肽类、磺胺类、四环素类和硝基吠喃类、硝基咪唑类等。与此相对应，细菌在抗菌药物的选择压力下发生突变而产生耐药性，耐药菌相继产生，且耐药性逐渐增强。任何一种新的抗菌药物问世后几年或十几年之内，必然出现与之对应的耐药菌，药物对细菌的抗菌作用以及细菌对抗菌药物的耐药性都处于不断变化中。由于抗菌药物的广泛应用，我国已成为世界上抗生素滥用最严重的国家之一。我们只有加强研究细菌耐药性的产生机制、合理使用抗生素，持续监测细菌耐药性的变化，才能控制细菌的耐药性，有效治疗感染性疾病。

二、细菌耐药性产生机制

细菌可通过不同机制产生耐药性，其最终结果是使抗菌药物完全或部分失效。细菌耐药性包括生物性和临床性的耐药、环境介导的耐药以及细菌介导的耐药。

（一）生物性耐药和临床性耐药

生物性耐药是指细菌对于原先表现为敏感的药物降低其敏感性。当敏感性降低至临床用药达不到有效程度时，则称为临床性耐药。生物性耐药和临床性耐药并不一定保持一致。大多数实验室检测着重于临床性．耐药，而实际上细菌在不断发生生物性耐药的变化。

例如，过去肺炎链球菌可被0.03 ug/mL或更低浓度的青霉素抑制，而临床实验室关注的标准是能否被2 ug/mL或更高浓度的青霉素抑制，这个浓度被认为是青霉素能够发挥药效的阙值。然而，尽管实验室在2 ug/mL或更高浓度的青霉素抑制下没有检测到肺炎链球菌能生长，此菌在生物性耐药方面已经发展成为需要10～50倍于0.03 ug/mL的青霉素浓度才能抑制。生物性耐药在不断地变化，虽然当今的实验室方法还不能准确的检测出所有过程，但是我们应当意识到细菌产生生物性耐药的情况一直在发生。

（二）环境介导的耐药

细菌耐药性的产生是药物、细菌及其所处环境相互作用的结果。环境中的物理或化学特性可以直接改变抗菌药物或改变细菌对于药物的正常生理反应，称为环境介导的耐药。这些环境因素有pH值、阳离子（如Mg²⁺和Ca²⁺）浓度、胸腺嘧啶含量和厌氧气体环境等。有些抗生素的药效会受到环境pH值的影响，如红霉素、氨基糖苷类的药效随着pH值的降低而减小，而四环素的药效却随着pH值的降低而升高。氨基糖苷类药物需要穿过细胞膜进入细胞内才能抑制细菌蛋白质的合成。抗菌药物在敏感菌体内的积蓄是通过一系列复杂的步骤来完成的，包括需氧条件下的主动转运系统，因此，在缺氧环境下药物进入细胞受到抑制，药物活性降低。氨基糖苷类药物的活性受环境中离子的影响，如Mg²⁺和Ca²⁺，特别是作用于铜绿假单胞菌时，氨基糖苷类药物带有净正电荷，铜绿假单胞菌的外膜带有净负电荷，这有助于药物吸附于细菌细胞表面。如果环境中也有大量带正电荷的Mg²⁺和Ca²⁺竞争吸附于细菌细胞表面，那么能够吸附于表面的药物就减少，从而使得药物的活性降低。环境中的某些代谢物和营养物质也会影响抗菌药物的活性。例如，肠球菌可利用胸腺嘧啶和外源性叶酸代谢物来逃避磺胺甲氧节啶对叶酸途径的抑制作用。也就是说，如果环境能供给细菌可利用的代谢物，那么通过抑制产生这些代谢物的途径来发挥作用的药物其活性则会大大降低，甚至完全失活。当环境缺乏这些代谢物时，细菌对药物的敏感性则恢复。

在建立标准AST方法时应考虑到这些环境介导的耐药因索，以最大限度地减少环境因素的影响，使试验结果能够更准确地反映细菌介导的耐药性。值得注意的是，AST的反应条件无法再现感染患者体内的生理环境，只能最大限度地检测出细菌表达的耐药性。因此，可以解释为什么AST的结果与临床上治疗效果并非完全吻合。

（三）细菌介导的耐药

体外药物敏感试验所检测的耐药性为细菌介导的耐药，取决于细菌遗传学特性，分为固有耐药（intrinsic resistance）和获得性耐药（acquired resistance)。

1．固有耐药也称天然耐药，由细菌的种属特性所决定，该耐药性可以根据细菌归类的种属推测出来。表11-1列出了常见的抗菌药物固有耐药以及耐药的机制。根据细菌的固有耐药性，可以将某些药物从AST的药物选择中排除，也可用来帮助鉴定细菌。例如，革兰阳性球菌的常规AST药物选择应当排除氨曲南，革兰阴性杆菌的常规AST药物选择应当排除万古霉素。

表11-1抗菌药物固有耐药举例

2．获得性耐药 细菌因基因变化引起细胞生理和结构的改变，从而导致的耐药称为获得性耐药。与固有耐药不同，获得性耐一药往往只发生于细菌种属的中个别细菌。因此，获得性耐药不能根据细菌的种属归类来推测，必须进行AST以检测其耐药性。获得耐药性的产生方式有以下三种。

(1)基因突变。所有细菌都经常发生随机突变，但频率很低，其中少数的基因突变能够产生耐药性。突变的频率与使用抗菌药物无关，但药物造成的选择性压力则有利于耐药突变株的存活，并最终成为优势菌群。

(2)通过基因传递机制从其他细菌获得耐药基因。质粒、转座因子和整合子都是可以传递耐药性的基因元件。质粒是细菌染色体之外的遗传物质，能够通过结合、转化、转导等形式传递耐药性。转座因子是能在质粒之间或质粒与染色体之间自行转移的核苷酸序列。转座因子分为三种：插入序列（insertion sequence,IS)、转座子（trarlsposon，Tn）和转座噬菌体（Mu phage)。转座因子几乎存在于所有的生物中，可能在遗传进化中起重要作用。整合子具有独特结构，可捕获和整合外源性基因使之转变为功能性基因的表达单位。它的结构由保守片段、整合酶基因、启动子和基因盒组成。基因盒是在两个保守片段间的区域插入的编码某些功能的基因，可以编码耐药性状，也可以编码细菌的其他多种适应功能。整合子对基因盒的捕获或剪切造成基因盒的移动，整合子本身也可位于质粒或转座因子上并在细菌间进行传播。

(3)以上两种方式的综合。

（四）常见的耐药产生途径

无论是固有耐药还是获得性耐药，细菌对于抗菌药物产生耐药的途径都非常类似，如产生药物灭活酶、改变药物作用靶点、药物摄取或积聚的减少、形成生物被膜等。

1．药物灭活酶细菌可产生多种酶以灭活药物，包括水解酶和修饰酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶。

(1)β-内酰胺酶：可水解β-内酰胺环使得β-内酰胺类药物失活，其水解率是细菌耐药性的主要决定因素。迄今为止所报道的β-内酰胺酶已经超过400种。按照Ambler氨基酸序列可将β-内酰胺酶分为A～D四类：其中A,C,D类酶以丝氨酸为作用位点；B类酶以金属锌离子为活性作用位点，故称为金属酶，如乙二胺四乙酸等金属离子鳌合剂与作用位点结合可抑制其活性。按照Bush功能分类法则将β-内酰胺酶分为四型：不被克拉维酸抑制的头抱菌素酶为第1型；被克拉维酸抑制的β-内酚胺酶为第2型；不被所有β-内酚胺酶抑制剂抑制的β-内酰胺酶（锌离子为活性作用位点）为第3型；不被克拉维酸抑制的青霉素酶为第4型。革兰阳性菌中的葡萄球产生的β-内酰胺酶较为稳定，很少发生突变；随着三代头孢的广泛应用，革兰阴性杆菌产生的TENI-1和SHV-1很快突变成超广谱的居内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)，其在临床上非常受重视，一旦ESBLs阳性，则认为对青霉素类和所有头孢．菌素类以及单环类药物均耐药，但对头霉素、碳青霉烯类以及酶抑制剂敏感。另一类是由染色体介导的头孢菌素酶，也称为AmpC酶(Bush分类法的第1型），几乎所有肠杆菌科菌和铜绿假单胞菌均产生AmpC酶，但产量很少，不足以导致耐药；此外某些细菌如阴沟肠杆菌，在β-内酰胺类药物诱导下可引起AmpC基因去阻遏，造成AmpC过量表达，导致细菌对除第四代头孢菌素、头霉素、碳青霉烯类之外的所有β-内酰胺类药物耐药。

(2)氨基糖苷类修饰酶：该酶能够修饰氨基糖苷类药物的结构，使药物和细菌核糖体的结合减少，是细菌对氨基糖苷类药物产生获得性耐药的重要原因。根据反应类型可分为：乙酚转移酶(N-acetyltransferases,AAC)，使氨基糖苷类药物游离的羟基乙酰化；磷酸转移酶(O-phosphotransferases,APH)，使游离羟基磷酸化；核苷转移酶(O-nucleotidyltranferases, ANT)，使游离羟基核苷化。这些酶可通过质粒将耐药性传播给敏感菌，即使没有明显遗传关系的细菌种属间也能传播。

2。改变药物作用靶点β-内酰胺类药物必须与细菌细胞内膜上的青霉素结合蛋白(PBP）结合才能抑制细菌细胞壁合成而起到杀菌作用。如果细菌获得外源性DNA，编码产生与药物低亲和力的PBP或者PBP本身发生结构修饰或点突变，降低与药物结合的能力，则导致对β-内酰胺类药物耐药。喹诺酮类药物的作用靶点是DNA解旋酶和拓扑异构酶，如果细菌的DNA解旋酶和拓扑异构酶的结构发生改变（相关基因gyrA和gyrB)，与喹诺酮药物不能有效结合，也会导致细菌的耐药。再如万古霉素等糖肽类抗生素的作用靶点是细菌细胞壁五肽聚糖前体的D-丙氨酰-D-丙氨酸，肠球菌如使之突变为D-丙氨酰-D-乳酸或D-丙氨酸，则不能与万古霉素结合（相关基因为vanA,vanB,vanC,vanD,vanE和vanG)，通过阻止万古霉素对细胞壁合成的抑制而导致耐药。

3．减少药物的摄取或积聚药物只有进入细菌细胞内才能发挥药效。细菌可通过下述三种途径减少对药物摄取或减少药物在细菌体内的积聚而导致药物失活。

(1)外膜通透性的改变。细菌细胞壁障碍或细胞膜通透性改变可形成一道具有高度选择性的屏障，使抗菌药物无法进入细菌体内。这类非特异性的耐药机制主要见于革兰阴性菌，它具有脂质双层结构的外膜和外层脂多糖，排列紧密，带有负电荷，允许亲脂性药物通过。抗菌药物的分子越大、所带负电荷越多，则越不容易通过细菌外膜。

(2)外膜孔蛋白的突变。革兰阴性菌外膜的脂质双层中镶嵌有多种通道蛋白，称为外膜孔道蛋白（porins)，可通过营养物质和亲水性抗菌药物。当外膜孔蛋白结构变异、减少或丢失时，药物进入细菌受到阻碍而导致耐药。如铜绿假单胞菌的外膜孔蛋白OprD突变后对碳青霉烯类抗生素产生耐药；大肠埃希菌的外膜孔蛋白OmpF和OMPC发生突变后对β-内酰胺类药物产生耐药。

(3）主动外排泵。某些细菌外膜上存在能量依赖的主动外排泵（efflux pumps)，可将已经进入菌体内的药物泵出，使得菌体内药物浓度不足以发挥药效而导致耐药。例如大肠埃希菌的AcrAB-ToIC外排系统可以导致细菌对β-内酰胺类药物、红霉素、四环素、氯霉素、氟喹诺酮类药物、利福平、氧化剂、碱性染料、有机溶剂等多种物质的耐药或抗性；铜绿假单胞菌的MexAB-OprM外排系统可使细菌产生多重耐药。研究显示，细菌的主动外排泵对于大环内酯类、四环素类、氟喳诺酮类药物的耐药产生起着重要作用。

4．形成生物被膜细菌在不利环境下可通过群体感应系统形成生物被膜。生物被膜是指细菌黏附于接触表面，分泌胞外多糖基质、纤维蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集的膜样物。关于生物被膜的耐药机制尚未定论，可能与被膜中大量的胞外基质阻碍了抗生素穿透生物被膜有关。此时药物只能杀灭生物被膜表面的浮游细菌，而不能充分渗透到深部以达到有效杀菌浓度。被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性还是对环境因子的敏感性等都与浮游细菌有显著不同，尤其表现为对抗生素及宿主免疫系统具有很强的抵抗力，从而引起许多慢性且难以治愈的感染性疾病。另外，细菌生物被膜黏附于各种医疗器械及导管上极难清除，也可引发医源性感染。