一、实验目的

掌握PCR反应的基本原理以及应用PCR检测食品中沙门菌的操作。

二、实验原理

以沙门菌高度特异性的invA基因为检测靶基因，设计PCR特异性引物，采用PCR对经富集后鲜牛奶中沙门菌的靶基因进行扩增，并采用电泳对扩增后的特异性DNA序列进行分析，从而检测与鉴定样品中的沙门菌。

三、仪器与试材

1．仪器与器材

PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、台式离心机、微量移液器。

2．菌种与引物

沙门菌(Salmonella，spp．)，invA基因的上游引物invAF：5‘tcctccgctctgtctactta3’与下游引物invAR：5‘accgaaatattcattgacgtt3’。

3．培养基与试剂

亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液与氯化镁孔雀绿增菌液(MM)、PCR缓冲液、脱氧核苷三磷

酸(dNTP)、TaqDNA聚合酶、TE缓冲液(pH=8.0)、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、DNAMark—er。

4．实验材料

3～4种不同品牌的鲜牛奶，各1(00mL。

四、实验步骤

1．增菌

(1)取10mL牛奶，加入90mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液。

(2)另取10mL牛奶，加入90mL氯化镁孔雀绿增菌液。

(3)将上述两种接种后的培养基置于37℃恒温摇床(150r／rain)上增菌培养16h。

2．PCR反应模板的制备

(1)取上述增菌液各1mL(或者各取0．5mL混合)，以12000r／min离心5min，弃上清液。

(2)沉淀加1mLTE缓冲液，用吸管反复吹打，使之重新悬浮。

(3)以12000r／min离心5min，弃上清液，加入100μLddH2O1，于沸水中煮15min，立即冰浴5min，以10000r／min离心3min，取5μL上清液作为反应模板。

3．PCR反应

(1)反应体系。按以下配比与顺序制备反应体系(20μL)：10×PCR缓冲液2．5μL、dNTP(2．5mtool／L)2．0μL、上下游引物(2c)μmol／L)各1．0μL、模板2．0μL、TaqDNA聚合酶（2μ/μL）1.0μL、ddH2O10.5μL.。

(2)反应条件为：94℃4min热变性；94℃40s、60℃40s、72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物置4℃保存。

4．结果判断

沙门菌的检测与鉴定过程非常复杂，在实验过程中一定要认真仔细，否则可能影响实验结果。

五、注意事项

1．在沙门菌的分析检测中，为了有效地扩增沙门菌数量，待检样品在以缓冲蛋白胨水进行增菌(又称为前增菌)后，常常需要采用选择性培养基对沙门菌进行选择性增菌。常用的选择性培养基包括四硫磺酸钠煌绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液和氯化镁孔雀绿增菌液3种。由于没有任何一种培养基可以保证食品等样品中各种血清型的沙门菌都得到扩增，所以往往选择其中两种选择性培养基同时进行选择性扩增。

2．亚硫酸铋(BS)琼脂培养基不需高压灭菌。制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性。应在临用前1d制备，储存于室温暗处。超过48h不宜使用。

3．在生化鉴定实验中，为了节约实验时间，可以在接种TSI和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素(pH一7．2)琼脂、KcN培养基。

4．沙门菌的检测与鉴定过程非常复杂，在实验过程中一定要认真仔细，否则可能影响实验结果。