一、实验目的

掌握饮用水中大肠菌群的滤膜测定法的原理与操作过程。

二、实验原理

用孔径0．45μm的微孔滤膜过滤饮用水样品，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在品红亚硫酸钠选择性培养基平板上，于36℃培养22～24h后，计数滤膜上大肠菌群菌落数。

三、仪器与试材

1．仪器与器材

超净工作台、生化培养箱、显微镜、滤器、滤膜(孔径0．45μm)、抽滤设备、无齿镊子、放大镜、培养皿(90‘mm)、吸管、锥形瓶、试管等。

2．培养基品红亚硫酸钠培养基(N／A)、乳糖蛋白胨培养液(LB)

3．实验材料

3～4种不同品牌的瓶装水，各250mL。

四、实验步骤

1．滤膜与滤器灭菌

将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，煮沸(每次15min)问歇灭菌3次。其中，前两次煮沸后，以蒸馏水洗涤滤膜2～3次。滤器于121℃灭菌20min，备用。

2．过滤

(1)用无菌无齿镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌滤器的滤床上，固定于滤器中，连接抽滤设备。

(2)将100mL水样(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在一0．5atm(负压，50.66kPa)下抽滤。

3．培养

(1)当水样滤完后，再抽气5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，将滤膜移放于品红亚硫酸钠培养基平板上，滤膜截留细菌面向上。

(2)倒置平皿，于36℃培养22～24h后，取出计数。

4．结果观察

(1)挑出符合下列特征的菌落进行革兰染色、镜检：紫红色、具有金属光泽的菌落；深红色、不带或略带金属光泽的菌落；淡红色、中心色较深的菌落。

(2)将镜检为革兰阴性的无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液中，于36℃培养24h，产酸产气者，则判定为大肠菌群阳性。

5．报告结果

按下式计算样品中大肠菌群菌落数(cfu／100mL)：

大肠菌群菌落数=[大肠菌群菌落数（个）/过滤的水样体积（mL)]×100

五、注意事项

1．本方法也适合其他液体样品如牛奶、自来水和环境水样中大肠菌群数的测定。

2．在培养过程中，应保证滤膜与培养基完全贴紧，两者问不得留有气泡，否则将可能使测定结果偏低。