随着临床医学和临床分子学检验的发展，核酸定量检测作为一项重要指标显得越来越重要，直接影响临床的治疗。目前核酸定量技术在诊断和个体化医疗、食品检验和转基因生物检测、病原体鉴定、法医科学等方面应用广泛，这些应用推动了核酸定量技术的进步。自1985年［1］聚合酶链反应（PolymeraseChainReactionPCR）技术问世以来，因其敏感性、直接性、准确性等特点，已经成为生命科学领域中主要的实验工具。实时定量PCR技术（qPCR）［2–3］是目前DNA含量测定最常用的技术，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光结合染料(SYBR®greenI)或荧光标记探针(如TaqMan®Probes)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。应用此项技术需要用已知浓度的标准物质去构建标准曲线，如果标准品与样品之间的背景基质存在差异，PCR扩增效率以及最终测定结果都会受到基质的影响，从而引起测量结果的偏差。另外，基于荧光染料基础上的技术如PicoGreen也被应用于DNA含量的测定中，应用荧光染料测定DNA的含量具有更好的灵敏度并且适用于测定低浓度的DNA含量。此项技术依赖于一个外部的标准，并且当DNA长度小于23kb时会低估DNA的浓度。目前一项检测和定量核酸的新技术即数字PCR技术［5–9］也被应用到了核酸含量的检测技术中。不同于传统的qPCR，数字PCR通过计数单个分子从而实现绝对定量，该技术采用直接计数目标分子数而不依靠任何校准物或外标。数字PCR在进行扩增反应前，将含有DNA模板的PCR溶液稀释后分布到大量的独立反应室，单分子间通过稀释分离，并且独自进行PCR扩增，最后分析每个扩增产物。该项技术因操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确等已成为分子生物学研究中的重要手段。笔者采用数字PCR技术对噬菌体λDNA含量进行测定，并对实验结果的影响因素进行了分析，对测量结果的不确定度进行了评定。

1实验部分

1．1主要仪器与试剂

荧光定量PCR仪：ABI7900型，美国ABI公司；振荡器：MS3型，德国IKA公司；

离心机：3–30K型，美国Sigma公司；紫外分光光度计：BioMarkSystem型，美国Fluidigm公司。TaqmanUniversalMasterMix(Taqman通用扩增反应液)：美国ABI公司；正反向引物、TaqMan探针：上海英潍捷基公司；20×上样缓冲试剂(20×Sampleloadingreagen)：美国Fluidigm公司；12.675数字矩阵芯片：美国Fluidigm公司。

1．2实验方法

1.2.1实时定量PCR

针对λDNA序列设计了引物，引物序列信息见表1。在进行数字PCR之前，采用实时定量PCR技术（ABI7900）对所需要的引物、探针浓度进行优化。实验过程中将溶解后的λDNA稀释为5个不同的浓度进行PCR优化实验。PCR反应体系主要包括TaqManUniversalMasterMix(2×)12.5μL，正反向引物各1.25μL(0.5μmol／L)，荧光标记探针溶液0.75μL（0.3μmol／L），DNA模板2μL，然后加去离子水到25μL。实时定量PCR循环反应条件：95℃起始变性10min；95℃扩增20s；60℃退火和延伸40s，50个循环。

1.2.2数字PCR反应

数字PCR采用12.765微流体dPCR芯片，此系统微流体dPCR芯片由12个独立的微流体面板(panel)和相应进样孔组成。每个面板含有765个6nL的独立反应室(partition)。4.6μL［9］反应液通过进样孔进入后被分配到765个反应室进行独立扩增。在实验过程中，仪器分析软件依据反应过程中的数字信号产生扩增曲线以及12个面板中每一个反应室的循环Ct值。在扩增完成后反应过程中产生的数字信号通过BioMark数字PCR软件进行分析。

1．3实验过程

采用重量法对溶解后的λDNA（用紫外分光光度计进行了初步浓度的测定）进行稀释，稀释的最终拷贝数分别计算为495，660copies／μL。所用到的正反向引物、探针序列同表1。数字PCR(10μL的反应体系)反应体系主要包括：TaqManUniversalMasterMix(2×)5μL，正反向引物20×SampleLoadingreagent1μL物各0.5μL(0.5μmol／L)，荧光标记探针溶液0.3μL（0.3μmol／L），20×SampleLoadingreagent1μL，DNA模板2.7μL。为了减小移液带来的误差，将PCR反应溶液（不包含样品DNA）进行预先混合，10μL的PCR反应液被加入到每一个样品面板中，大约4.6μL反应液通过进样孔进入后被分配到765个反应室进行独立扩增。数字PCR的循环反应条件同1.2节实时定量PCR技术（ABI7900）的循环反应条件一致。在扩增完成后反应过程中产生的数字信号通过BioMark数字PCR软件进行分析。实验手动设置阈值为0.65，目标循环数范围为35～50。

2 结果与讨论

2．1实时定量PCR的结果

在进行数字PCR技术定量λDNA含量之前，采用实时定量PCR技术对实验条件进行优化。最终根据扩增效率优化实验条件。实时定量PCR得到实验结果,见表2。

对于实时定量PCR的实验结果，标准曲线以样品扩增的Ct值为纵坐标(Y)，所稀释的样品的浓度为横坐标(X)。根据标准曲线的线性斜率k值以及公式e=10–1／k–1计算定量PCR的扩增效率。PCR理想扩增效率为100%时标准曲线的斜率应为–3.32；允许的扩增效率为90%～110%时，标准曲线斜率的平均值应在–3.6～–3.1之间。由表2结果可以看出，扩增效率以及扩增斜率的结果均在理想范围之内，由此可知，实时定量PCR优化的最终条件满足检测要求。

2．2数字PCR测定结果

将数字PCR稀释到两个拷贝数水平（660，495copies／μL），稀释后的样品在12.765数字矩阵芯片上进行数字PCR实验。对于两个拷贝数水平的稀释液,同时做5个重复样。λDNA的数字PCR扩增平台见图1、图2。在反应室中如果DNA目标分子的扩增反应发生了，则反应室就以阳性结果标注，由图1、图2可以看出，大部分阳性反应室的Ct值在21～31之间。测定结果的相对标准偏差为0.149／2.428=0.061，实时定量PCR测量结果的相对标准差为10%～20%，

可见该方法的精密度优于实时定量PCR。中国计量科学研究院以该λDNA研制的含量标准物质参考值为(2.53±0.21)μg(k=2)(未发表数据)，液相色谱–同位素稀释质谱法测量结果为(2.51±0.059)μg

(k=2)(未发表数据)，两种方法的测量结果相符合，验证了该方法的准确性。

3 不确定度评定

3．1A类不确定度实验对于两个不同的稀释拷贝数分别进行5次实验，测定结果见表3。测定数据符合正态分布，uA=s／10-1=0.0614。则相对不确定度uA,rel=0.0614／2.428=0.0252。

3．2B类不确定度

(1)稀释样品中所含有的拷贝数浓度TP的不确定。为了得到稀释样品中所含有的拷贝数浓度TP的不确定度，需要对M以及VP的不确定度进行分析。假设M的标准不确定度为uM，每个嵌板中的反应室呈阳性的概率为P,即P=H／C。

（2）总相对分子质量引入的不确定度

根据国际纯化学与应用化学联盟（IUPAC）公布的原子量表，元素P，H，C，N，O的相对原子质量及不确定度见表4。

依据λDNA的核酸序列，以及各个脱氧核苷酸的分子式可以算出λDNA中C，H，O，N，P的总个数，然后分别计算各元素引入的总不确定度，最后经计算得出总相对分子质量引入的相对不确定度为Uc’rel=2.41×10–6。

（4）阿伏伽德罗常数引入的不确定度

国际科学数据委员会（CODATA）工作组每4年更新一次数百个尚未确定的物理常数。阿伏伽德罗常数的相对标准不确定度为Uc’rel=4.400×10–8。

3．3合成不确定度及扩展不确定度

根据合成不确定度公式计算得合成相对不确定度为uc,rel=0.0719，λDNA量为2.428μg／管，则合成不确定度u=0.0719×2.428μg／管＝0.174μg／管。取包含因子k=2，则扩展不确定度：U＝0.174μg／管×2＝0.35μg／管,因此PCR测得的λDNA含量为(2.43±0.35)μg／管，k=2。

4 结论

运用数字PCR芯片技术测量了λDNA含量，PCR技术需要解决的一个重要问题是稀释水平梯度与理想的目标分子拷贝数的对应关系。目前数字PCR和实时定量PCR技术都被应用于检测DNA拷贝数，但是与实时定量PCR相比，数字PCR可以检测较低拷贝数的目标DNA分子。数字PCR技术可以作为测定核酸拷贝数以及核酸质量浓度的首选技术。为了得到更准确的实验结果，实验中考虑测量值的偏差与不确定度是非常重要的。本研究综

合考虑了实验过程中影响结果的各种因素，并对这些因素进行了不确定度分析。通过与液相色谱–同位素稀释质谱法测量结果相比较证明数字PCR技术测定结果可靠。