一、实验目的

    掌握分光光度法测定蔬菜中有机磷农药残留的原理和方法。

    二、实验原理

    样品经酸消化后，磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵后，经对苯二酚、亚硫酸钠还原成在660nm波长处有吸收峰的蓝色化合物——钼蓝，吸光度的大小与样品中磷的含量成正比。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    分光光度计、植物组织捣碎机、可调电炉、消化瓶等。

    2．试剂

    除特别注明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂：HClO₃、HNO₄、H₂SO₄、钼酸铵[(NH₄)₆Mo₇0₂₄·4H₂O]、对苯二酚、Na₂SO₄、KH₂PO₄(优级纯)。

    (2)常规溶液：HClO₃一HNO₄混合酸(1+4，体积比)、H₂SO₄溶液(15％，体积分数)、对苯二酚溶液(0.5％，在溶液中加入一滴H₂SO₄以减缓氧化作用)、钼酸铵溶液(O.5％，以H₂SO₄溶液配制)、Na₂SO₄溶液(20％，现配现用，否则可能使钼蓝溶液发生浑浊)。

    (3)磷标准储备液(100μg／mL)：称取O.4394g在105℃下干燥的KH₂PO₄，置于1000mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。

    (4)磷标准使用液(10μg／mL)：吸取10mL磷标准储备液，置于100mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。

    3．实验材料

    2～3种新鲜小白菜、长豆角，各200g。

    四、实验步骤

    1．样品消化

    (1)取100g样品于植物组织捣碎机中捣碎。

    (2)称取5g捣碎样品于100mL消化瓶中，加入3mL H₂SO₄溶液和3mL HClO₃一HNO₄混合酸，置于电炉上消化至溶液为无色或微带黄色的清亮溶液。

    (3)待溶液冷却后，加入20mL水，转移至100mL容量瓶中，并用水洗涤消化瓶数次，洗液合并倒入容量瓶内，加水至刻度，混匀，备用。此溶液为样品测定液。    

    (4)取与消化样品同量的H₂SO₄、HClO₃一HNO₄混合酸，按相同方法做试剂空白试验。

    2．标准曲线的绘制

    (1)吸取磷标准使用液O、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL(相当于含磷O、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg)，分别置于20mL具塞试管中，分别加入2mL钼酸铵溶液摇匀，静置几秒钟。

    (2)加入1mL Na₂S0₄溶液、1mL对苯二酚溶液摇匀后，加水至20mL，混匀。

    (3)静置0．5h以后，于660nm处测定吸光度。以吸光度对磷含量绘制标准曲线。

    3．样品测定

    (1)吸取2mL样品测定液和试剂空白试验溶液，分别置于20mL具塞试管中，加入2mL钼酸铵溶液摇匀，静置几秒钟，然后按照“标准曲线的绘制”(2)、(3)的操作进行，测定A_660nm。

    (2)根据A_660nm值，从标准曲线上查得样品测定液和试剂空白试验液中磷的含量。

    4．计算

    按下式计算样品中磷(有机磷农药残留)的含量：

        (m₁一m₂)V₁

    x=────────×100

           mV₂×1000

    式中，x为样品中磷的含量，mg／100g；m₁为样品测定液中磷的质量，μg；m₂为试剂空白

液中磷的质量，μg；V₁为样品消化液的定容总体积，mL；V₂为测定用样品消化液的体积，mL；

m为样品的质量，g。

    五、注意事项

    1．本方法的最低检出限为2μg。

    2．在测定过程中，很多试剂包括样品本身都可能含有磷，因此在测定过程一定要注意消除这些磷对实验结果的干扰。

    六、思考题

    1．写出在酸性条件下磷与钼酸铵结合生成磷钼酸铵的反应式。

    2．除通过试剂空白试验消除试剂中磷对测定结果的影响外，如何减少或消除食品组成成分中磷对实验结果的影响?