缺血性心肌病是威胁人类健康的重大疾病之一。尽管血管介入疗法治疗心绞痛，能够改善心肌功能、降低心肌梗死的风险，然而对于终末期心功能衰竭患者的疗效却十分有限。间充质干细胞移植后可分化为血管内皮细胞和心肌细胞，可为组织修复提供细胞来源，同时间充质干细胞可分泌VEGF,EGF,TGF等多种细胞因子，促进血管新生。间充质干细胞移植能够修复和再生受损心肌、促进血管新生、缩小心肌梗死面积及改善心功能。

［材料]

1．组织来源 骨髓、外周血、脂肪组织或脐带血与脐带组织。

2．心肌定向分化培养用试剂生理盐水，肝素，粒细胞集落刺激因子（G-Gbf) ,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF) ,5-杂氮胞苷，Ficoll-hypaque分离液，0.25% EDTA-胰酶。

3．培养基配方和制备无血清培养基。

4.实验器材 二氧化碳培养箱，电动移液器，一次性刻度吸管，50ml离心管，15 ml离心管，骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪，低温离心机，培养瓶。

【方法】

1．取材采集骨髓、外周血、脂肪组织或脐带血与脐带。

2．间充质干细胞分离骨髓血（同外周血、脐带血）或脂肪组织、脐带间充质干细胞的分离方法详见第五节。

3．心肌细胞定向分化培养采用无血清培养基（可含10％供者灭活血清）将细胞调成悬液，按2x 10⁵/Cm²接种于培养瓶，37℃,5% CO₂孵箱中培养3天，吸弃非贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养。培养10天左右，贴壁细胞形成同质克隆后，吸弃培养上清液，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化2分钟左右（根据实际消化情况判定），待细胞变圆形浮起，终止消化。干细胞于4℃下、2000r/min离心5分钟，弃上清液。无血清培养基将细胞调成悬液，按8000/cm²密度将细胞接种于新的培养瓶中，每3天换液。传代2次，待细胞长满后。吸净培养上清液，加入含5-杂氮胞苷（10 umol/L )及bFGF(10ug/L)的新鲜培养基，培养24小时后，生理盐水洗细胞2次，加入不含5-杂氮胞苷的培养基，每周换液2次，培养2周。取5 ml上清液用于细菌培养。胰蛋白酶消化细胞，细胞悬液2000r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，2000r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度用于移植。

4．细胞表型特征心肌细胞表现型征为CD13, CD29 , CD44 , CD71，阳性；CD3,CD14,CD15,CD33,CD34,CD38,CD45与HLA-DR阴性。心肌细胞表达肌小节肌动蛋白、心肌特异性转录因子Nkx25/Csx与GATA4，产生自发性、节律性搏动的细胞团。

5．间充质干细胞或心肌细胞的应用方法可根据病情将新分离的间充质干细胞直接移植、扩增培养后移植或心肌细胞定向分化诱导培养后移植。间充质干细胞或心肌细胞的移植途径主要是在开胸手术下直接心肌内注射、冠状动脉导管注射，或经外周静脉注射、经皮介入心内膜下移植等。

【结果】

1．间充质干细胞、心肌细胞定向分化培养培养结果24小时后，有少量细胞开始贴壁；培养3～4天可见细胞呈集落生长，细胞形态多样，多呈梭形或多角形；培养5～7天可见集落中的细胞呈放射状排列，细胞伸出长短不一的突起；培养10天左右细胞融合成片状单层。细胞覆盖瓶底80％～90％时传代，传代后细胞增殖加快，细胞排列更加整齐。加入5-杂氮胞苷及bFGF后，细胞体积增大，形态逐渐变为长梭形，排列整齐，并出现自发性、节律性搏动。

2．间充质干细胞或心肌细胞移植结果心肌单光子发射计算机断层、超声心动图和核素心室造影等检查结果显示，间充质干细胞或心肌细胞移植2～4个月后，心肌梗死面积减小、心脏射血分数增加、舒张末压降低。

【注意要点】

1．移植细胞数量间充质干细胞移植的数量对疗效有较大的影响，数量少，不易达到治疗效果；而数量过大易引起细胞栓塞、沉着和增生。一般认为间充质干细胞移植剂量范围可在106～108之间，最佳移植剂量为5x10⁶细胞。

2．移植时间最佳的细胞移植时间窗尚无定论，一般认为于心肌梗死后1～4周可能是干细胞移植的最佳时机。急性期移植虽然有利于间充质干细胞归巢至心肌梗死部位，但却容易导致移植细胞死亡。许多报道显示急性期间充质干细胞移植，干细胞的存活率、左室心功能及缩小瘢痕面积明显低于梗死发生1～2周后移植的效果。首次移植可采用自体骨髓间充质干细胞分离后直接移植，第二次移植可采用扩增培养或心肌细胞定向分化培养的细胞移植。

3．移植方式 干细胞的心脏移植方式有开胸直接心肌内注射、外周静脉输注、经皮心内膜下移植、冠状动脉导管介入注射等。每种方法都有各自的优缺点，在移植时要根据患者的身体条件、心肌梗死程度与时间加以选择。①开胸心肌内注射干细胞，虽然定位准确、便于注射，但需要做开胸手术，多数患者难以承受，同时有诱导心律失常及细胞回漏等弊端，要极为慎重选择；②通过外周静脉注射的方法简单易行，但干细胞可归巢到非心脏组织，缺血区的干细胞分布不足；③心内膜下移植不需要开胸手术，但注射位置固定较难，有致心律失常和心脏穿孔的潜在危险性；④将干细胞通过冠脉导管直接注射到病变冠状动脉内的优点是能够将干细胞直接注射到目标心肌，具有创伤性小、移植细胞数量易于控制等优点，但需避免因球囊阻塞冠脉时间过长而致的心肌缺血，同时需要调整好干细胞悬液的浓度，防止细胞栓塞导致微梗死形成。