骨髓、外周血、脂肪组织、脐血及脐带间充质干细胞可用于组织修复与再生的临床研究。目前，临床研究常采用自体骨髓、外周血间充质干细胞。自体间充质干细胞的采集方法：①骨髓干细胞：在患者骼嵴部位穿刺抽提骨髓血；②外周血干细胞：应用血细胞分离机采集经G-CSF动员的外周血单个核细胞，此法是采用较多的干细胞采集方法。

由于基质干细胞缺少特异性表面标志，流式细胞仪分选法和免疫磁珠阳性选择法的效果不理想，且分离过程中可造成间充质干细胞的损伤或由于抗体的结合对细胞的分化产生影响。为此临床研究多采用密度梯度离心法与贴壁分离法相结合的分离方法。

【材料】

1．组织来源骨髓、外周血、脂肪组织或脐血与脐带。目前临床研究采用自体骨髓、外周血居多。

2．培养用试剂生理盐水、肝素、G-CSF, Ficoll-hypaque分离液、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化分散液。

3．培养基配方和制备无血清培养基（临床研究专用培养基），不加任何抗生素。

4．实验器材电动移液器，一次性刻度吸管，15 ml离心管，50ml离心管，一次性注射器，骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪，低温离心机，培养瓶，嘎斯灯，100目滤网，co₂细胞培养箱，倒置显微镜，净化工作台，流式细胞仪，荧光显微镜，制水仪，试剂保藏冰箱，热合仪，洁净服，一次性无菌纸巾，无菌口罩，帽子，手套等。

【方法】

1．取材

(1)外周血干细胞采集

1)体内干细胞动员：患者如没有感染、肾危象、心包大量积液等禁忌证，可进行干细胞动员。目前常使用的动员剂有粒细胞集落刺激因子（G-CSF) ,粒巨细胞刺激因子（GM-CSF)、血管内皮生长因子（VEGF）和基质源性生长因子-1 (SDF-1)。其中G-CSF应用最广泛，G-CSF是传统的、强力的骨髓干细胞动员剂，可同时动员造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞。G-CSF动员方法是G-CSF 150ug皮下注射，每12小时1次，连用4～5天，然后进行干细胞采集。或术前12小时，肌内注射粒细胞集落刺激因子300mg。

2）多功能细胞分离机采集：采用多功能细胞分离机分离单个核细胞，成人一例采集量为50～200ml细胞悬液，采集次数不超过2次。一般循环处理血量不少于10OOOml。

(2）骨髓干细胞的采集方法：局部麻醉下行骨髓穿刺术。注射器内先吸取肝素2ml(6000U)，使肝素充分附着于注射器内壁。取骼骨上缘为穿刺点，每侧3～5个点，每点抽取骨髓8～20ml，共采集骨髓150～180m1。术中监测患者心电图、脉搏、血压等生命体征，术后在监护病房观察12小时。

(3)脂肪组织的采集方法：采用吸脂术或手术采集脂肪组织。

(4）脐带血的采集方法：新生儿娩出后，用两把止血钳分别将近儿端和近母端脐带夹住，在近母端止血钳处消毒脐带并将针头插入，采集脐血。

(5)脐带组织的采集方法：新生儿娩出后，用止血钳分别将近儿端和近母端脐带夹住，剪下脐带，并将脐带放入运输培养基（Eagle基础培养基，添加150ug/ml庆大霉素和1ug/ml两性霉素B)中送至实验室分离干细胞。

2．分离干细胞

（1)外周血、脐血及骨髓间充质干细胞的分离：采用密度梯度离心法分离干细胞。将外周血、脐血或骨髓血置于离心管中，50mg／管。用电动移液器反复吹打后，4℃,1800r/min离心10分钟，吸弃上清液。加入生理盐水5毫升／管，混匀细胞。将细胞合并于一支50ml离心管，加生理盐水补足50ml。取7支15 ml离心管，加入Ficoll-hypaque分层液（密度为1.077±0.001）,7毫升／管，沿管壁缓慢滴加入细胞悬液，7.1毫升／管。室温1800r/min离心20分钟。毛细管收集单个核细胞层细胞并移至50ml离心管。加生理盐水至50ml,4℃,2000r/min离心10分钟，弃上清液。重复2次。细胞计数，将细胞调成一定浓度直接用于移植或用于培养。

(2）脂肪组织间充质干细胞的分离：无菌条件下取脂肪组织，将脂肪组织剪成lcm大小组织块，加入0.1％胶原蛋白酶1 ,37℃消化1小时，然后2000r/min离心10分钟，弃上清液，加入无血清培养液重悬沉淀，100目滤网过滤，滤液经2000r/min离心10分钟，弃上清液，计数细胞，将细胞调成一定浓度用于培养。

(3)脐带间充质干细胞的分离：去除血管，将脐带组织剪成1～3cm大小组织块，用无血清培养基洗2次，将组织浸泡在0.1％胶原酶中，37℃消化4～6小时。加入生理盐水（消化液体积的2倍），2000r/min离心5分钟，弃上清液，加入2.5％胰蛋白酶,37℃处理30分钟，加入生理盐水（消化液体积的2倍）,100目滤网过滤，滤液2000r/min离心5分钟，弃上清液。重复2次。细胞计数，将细胞调成一定浓度用于培养。

3．间充质干细胞扩增培养方法

(1)外周血、骨髓血及脐血间充质干细胞的扩增培养方法：采用无血清培养基（可含10％自体灭活血清）将细胞调成悬液，按2x10⁵/cm²接种于培养瓶，37℃,5% C0₂条件下培养3天，吸弃非贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养，每3天换液一次，细胞覆盖瓶底80%～90％时胰酶消化细胞并传代。培养3周左右，胰酶消化细胞，2000r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，细胞悬液2000r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度用于移植。

(2)脂肪组织间充质干细胞的扩增培养方法：采用无血清培养基（可含10％自体灭活血清）将细胞调成悬液，按2x10⁴/cm²接种于培养瓶，37℃,5% C0₂条件下培养48小时，吸弃非贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养，每3天换液，细胞覆盖瓶底80％～90％时胰酶消化细胞并传代。培养3周左右，胰酶消化细胞，2000r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，细胞悬液2000r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度备用。

(3）脐带间充质干细胞的扩增培养方法：采用无血清培养基（可含10％受者灭活血清）将细胞调成悬液，按2x10⁴/cm²接种于培养瓶，37℃,5% C0₂条件下培养4天后全量换液，弃去非贴壁细胞。每3天换液，观察细胞至80％融合时，0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA消化，按1:3传代。培养3周左右，胰酶消化细胞，细胞悬液2000r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，2000r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度备用。

4.干细胞的表型特征骨髓间充质干细胞表型特性为：CD34^-CD45^-CD73⁺CD29⁺；脂肪间充质干细胞表型特征为：CD13⁺CD29⁺CD31^-CD34^- CD44⁺ CD45^- HLA^-DR^- CD105⁺；脐带间充质干细胞表型特征为：CD31^-CD34^-CD45^-CD44⁺CD73⁺CD90⁺CD105⁺HLA^-DR^-。

5．应用间充质干细胞的应用主要有如下方法：①间充质干细胞分离后直接应用；②间充质干细胞体外扩增培养后应用；③间充质干细胞分化诱导培养后应用；当组织损伤较轻、残留组织细胞较多时，一般采用间充质干细胞分离后直接移植或体外扩增培养后移植，通过组织微环境的诱导作用使干细胞分化为相应的组织细胞，如：骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞及胰岛β细胞等；而当损伤重、组织破坏较大时，一般在体外将间充质干细胞诱导分化成组织细胞后，再进行组织定位移植。

【结果】

1．外周血、骨髓血及脐血间充质干细胞的扩增培养结果新分离的骨髓单个核细胞的形态见图12-2，培养24小时后少量细胞开始贴壁，培养3～4天可见细胞呈集落生长，单个细胞呈梭形或多角形（图12-3)，培养5～7天可见集落中的细胞呈放射状排列，细胞伸出长短不一的突起（图12-4、图12-5)。培养10天左右细胞融合成片状单层。细胞覆盖瓶底80％～90％时细胞传代，传代后细胞增殖加快，细胞排列整齐有序。

2．脂肪组织间充质干细胞的培养结果原代细胞培养72小时后细胞贴壁，培养5天后

细胞呈纺锤形或不规则多角形；培养9天后梭形细胞增多，并呈旋涡状密集排列。培养10天左右细胞传代，传代后细胞排列更加整齐，继续培养5天左右细胞即可融合成片状。多次传代后细胞呈均匀排列。

3．脐带间充质干细胞培养结果新分离的脐带单个核细胞呈纺锤形，原代培养6小时后有大量细胞贴壁，贴壁细胞呈梭形、多角形。培养7天细胞呈长梭形，细胞呈平行或旋涡状排列。培养10天细胞可达80％融合。传代后的细胞形态无明显改变，排列更加整齐。

【注意要点】

1．干细胞采集要严格执行无菌操作，注意采集器不要吸入空气，采集后注射器加盖，放入无菌托盘传入GMP实验室。

2．外周血、骨髓血及脐血采集之前，采集器要肝素化，采集之后要使血液与肝素充分混匀，防止小的凝块形成。

3．消化过程中应该注意培养细胞的形态变化，一旦细胞连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化，避免消化过度而导致细胞损伤。

4．在无血清培养基中加入细胞供者的灭活血清或血浆有利于细胞生长。血清或血浆56℃水浴30分钟，然后3000r/min离心10分钟，即可使用。

5．培养瓶移入、移出培养箱，注意用乙醇喷洒消毒，并用灭菌纸巾擦拭干净。