在研究或筛选化合物对生殖过程的影响时，除观察化合物对整体的生育影响外，也可选择离体方法。细胞、组织培养是离体方法中主要的一种方法。具有用药量小、观察周期短及可同时测定一批化合物的活性的特点，结果与整体效果有较好的相关性。

一、黄体细胞培养实验

【原理和目的】

将药物加入培养的黄体细胞悬液中通过一定时间的培养后，用放射免疫分析法（RIA )测定黄体酮或cAMP水平，可研究药物对卵巢黄体功能的影响。

【材料】

1. M199培养基含0.1％牛血清清蛋白（BSA) pH 7.3，根据实验要求，也可采用其他培养基。

2. M199培养基含2％牛血清清蛋白pH 7.3。

3．孕马血清促性腺素（PMSG) 250U/ml生理盐水。

4．人绒毛膜促性腺素（hCG) 1251U/ml生理盐水。

5．胶原酶和DNase液 胶原酶500U和DNase 4ug/ml。

6．黄体组织可取自人、大鼠和猴，一般常用幼年大鼠。Wistar或SD种大鼠24～26日龄、雌性。

【方法】

大鼠皮下注射PMSC 0.2ml(50u/只）,56小时后皮下注射HCG 0.2ml (251U／只）造成假孕。注射hCG后6～7天的假孕大鼠，在无菌条件下取出双侧卵巢（此时卵巢几乎全部由黄体组织构成），用培养液洗涤三次后，剥去外层白膜，称重，放入M199含2% BSA培养基内，用4号针头刺破黄体，再剪成约lmm3大小的碎块，转移至50ml三角烧瓶内，按50mg/ml比例加入胶原酶和DNase液，于37℃振荡孵育60分钟，分别在温孵30分钟和60分钟时，用吸管轻吹打组织块各30次，以加速细胞的分散。消化60分钟后，将细胞悬液通过200um孔径的尼龙筛，收集滤液分装于l0ml的试管内，室温800r/min离心5分钟，将细胞沉淀用M199含0.1 % BSA培养基洗涤2次，再将细胞沉淀混悬在M199含0.1 % BSA培养基内，以血细胞计数器计数细胞，调整细胞数在106/ml。活细胞用锥虫蓝检查，细胞存活率应在80％以上。

【结果与分析】

温孵管12mmx75mm，加入细胞悬液0.8m1，测试药物或／和HCG，或空白培养基，使终体积为1ml。置37℃水浴振荡中（100～120次／分钟）培养，通以95% O₂和5% CO₂混合气。按实验需要，加入受试药物后，一般继续培养24小时。培养结束后，2000r/min离心10分钟，分离出上清液，-20℃保存。用RIA法测定黄体酮或cAMP水平，以便研究药物对卵巢黄体功能的影响。同时进行存活细胞计数；并用Bliss法计算受试药物作用于黄体细胞的ED50。

【注意事项与评价】

1．注意无菌操作。

2．受试药物，一般溶于乙醇中，配成1 mg/ml的母液。实验前以培养液稀释成所需浓度，乙醇的最终浓度应低于1%。