血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）的迁移和增殖既是机体对损伤的修复反应，也是血管增生性疾病发生发展的主要病理基础。众多体内活性物质具有刺激血管平滑肌细胞迁移的作用（促迁移因子，如 Ang II磷酸化HSP27、血小板源性生长因子-BB,内皮素-1等）。利用培养的血管平滑肌细胞可有选择地研究药物对平滑肌细胞迁移的影响及相关机制。

【材料】

1. SD大鼠。

2．试剂 0.1％胰蛋白酶,0.1％胶原酶,MEM培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L谷氨酰胺，10万u/L青霉素和l00mg/L链霉素）。Hanks液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS0₄·7H₂0 0.20g,KH₂P0₄ 0.06g，NaHC0₃ 0.35 g, glucose 1.OOg，酚磺酰0.02g)。重组PDGF-BB ; Ang II ; FIX荧光标记的鬼笔环肽；磷酸化HSP27单克隆抗体；总HSP27多克隆抗体、即用型SP试剂盒、a-平滑肌动蛋白单克隆抗体、western-blot试剂等。

3．仪器及器械细胞培养仪器及器皿，Boyden chamber迁移槽和聚碳微孔膜、激光共聚焦显微镜，离心机、手术器械等。

【方法】

1．大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养（组织块培养法）SPF级8周龄SD大鼠，雌雄不限。颈椎脱臼致急死，无菌操作取主动脉，仔细分离血管中膜，剪成体积约1 mm3的组织块种植于培养瓶中，密度约1块/cm²，加入含15％小牛血清DMEM培养基3 ml，移入饱和湿度、5% C0₂ ,37℃培养箱中静置培养，从第3天起，用倒置显微镜观察细胞生长情况，每周换液2次。原代培养的细胞生长汇合覆盖瓶壁的70％以上时，用0.25％胰酶消化传代。

根据光镜下平滑肌细胞的谷峰生长方式及。a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。

2．实验设计选用传代3～5代处于对数生长期血管平滑肌细胞，吸弃原培养液，换用含0.2％血清的DMEM培养液继续培养24小时，使细胞处于G0/G1期，随机分组进行实验。实验分为：对照组，模型组（促迁移因子干预组），不同浓度药物干预组，模型+不同浓度（一般2～3个浓度）药物干预组。根据测定指标，药物干预可在模型制备前或模型同时。以重组PDGF-BB或Ang II为迁移刺激物。

【结果与分析】

1．细胞迁移测定采用Boyden微孔膜双槽法。聚碳微孔膜（8um孔径）用0.01% gelatin煮沸1小时，晾干后备用，实验前用铅笔编号。细胞悬液先与干预药物在37℃,5% CO₂培养箱中温育60分钟后再进行细胞迁移测定。聚碳微孔膜隔开上下槽，上槽加入0.4m1密度2.5x10⁵/ml细胞悬液（细胞总数为1x10⁵），下槽加入趋化（迁移）刺激物（重组PDGF-BB 10ug/L或Ang II 10-6mmol/L)。置于37℃,5% C02培养箱孵育，4小时后弃去上槽细胞悬液，聚碳微孔膜移至染色架，用95％乙醇固定10分钟，0.5％甲苯胺蓝染色40分钟后，用棉签轻轻刮去聚碳微孔膜朝上槽的一面留下多余的细胞，压片固定。留在膜上的则为移行通过微孔附着在聚碳膜下槽面的血管平滑肌细胞，光学显微镜观察，计数膜上相对固定区域的5个高倍视野（x200）的细胞数。为减少误差，每个点同时平行做两张膜，取均值（图11-19)。

确定促迁移因子对细胞迁移的影响：

以对照组迁移细胞数为100%，分别计算不同处理组迁移变化百分率

迁移变化（％）=（处理组迁移细胞数-对照组迁移细胞数）÷对照组迁移细胞数x100

2．细胞骨架的观察应用细胞爬片鬼笔环肽FITC荧光染色法观察细胞内纤维形肌动蛋白（F-Actin )表达及排列情况（图11-20)。

将培养第3代细胞接种于预先置入盖玻片的6孔培养板中，37℃,5% C0₂培养箱中静置培养。待盖玻片上细胞近70％～80％汇合时，吸弃原培养液，换用含0.2％血清的DMEM培养液继续培养24小时（细胞处于Go/G1期）随机分组。药物干预组先将药物细胞共孵育1小时后再加入刺激物（重组PDGF-BB 10 ug/L或Ang II 10-6mmol/L）作用2小时。小心取出盖玻片，PBS冲洗3次。4％多聚甲醛室温固定30分钟，PBS冲洗3次。0.1 % TritonX-100通透30分钟，PBS冲洗3次。滴加鬼笔环肽FITC (2.5 mg/L)，室温潮湿暗盒中静置60分钟，PBS冲洗3次。晾干，置于洁净无荧光载玻片上，激光共聚焦显微镜下观察。

重组PDGF-BB 10ug/L或Ang II 10-6 mmol/L可使血管平滑肌内F-Actin数量较对照组明显增加，纵向平行排列，形成应力纤维丝（图11-21)。

【注意事项】

1. Boyden微孔膜双槽法测定细胞迁移，应根据细胞大小选择适宜孔径的细胞培养嵌套和微孔膜。

2．鬼笔环肽有较大毒性，操作时应注意防护。

3．有资料报道，鬼笔环肽FITC极易透入细胞，方法中可省略0.1% Triton X-100通透过程。