通过对培养的心肌细胞停止／恢复糖及氧供，建立模拟的心肌缺血／再灌注损伤模型，以观察药物对细胞形态、生理、生化功能的影响，从细胞水平评价药物对缺血及再灌注损伤心肌的保护作用并可深入进行相关机制研究。

【材料】

1．新生SD大鼠。

2．试剂 培养基（MEM,DMEM)，新生牛血清，0.08%胰酶，0.1％苯扎溴铵（或75％乙醇）,95% N₂/5% C0₂混合气体，MTT, CK-MB,LDH测定试剂盒等。

3．仪器及器械净化工作台、C0₂孵箱、细胞培养用器皿，倒置显微镜、离心机、磁力搅拌器、手术器械、200目金属筛、恒温水浴等。

【方法】

1．原代乳鼠心肌细胞分离、培养无菌条件下取出新生1～3天乳鼠心脏，留取心室，充分剪碎，重复0.08％胰酶消化完全后，差速贴壁法去除成纤维细胞，用含15％新生牛血清、100U/ml青霉素和l00 ug/ml链霉素的DMEM培养液将心肌细胞悬浮，细胞密度1x10⁶/ml接种于培养板（同时加入0.1mmol/L 5-BrdU以抑制成纤维细胞生长）,37℃,5% C0₂孵箱中培养，48～72小时达到单层同步搏动后即可进行实验。

2．缺氧／复氧损伤模型制备将上同步化细胞换用经95% N₂-5% C0₂饱和（充气20分钟）的无糖MEM培养液，置于95% N₂ -5% C0₂孵箱中培养（缺氧）,2小时后，再以含15％新生牛血清DMEM替换无糖MEM并置入常氧5% C0₂培养箱继续培养（复氧）4小时。

3．实验设计将细胞随机分为正常对照组（细胞不做任何处理，正常培养6小时）；损伤模型组；损伤模型+受试药物干预组（缺氧2小时，复氧同时分别加入不同浓度药物共培养4小时）；损伤模型+阳性对照药物干预组（缺氧2小时，复氧同时分别加入不同浓度药物共培养4小时）；根据需要设损伤模型+药物溶媒组（处理同药物干预组）。

用于细胞缺氧缺血及再灌注损伤指标众多，可根据研究需要及实验室设备条件适当选取。常用的有细胞一般状态及形态学变化指标，如细胞搏动、形态等，还可用细胞玻片常规染色、特殊染色生物显微镜下观察，电镜观察等；细胞生物学化学指标变化，如乳酸脱氢酶(LDH）肌酸激酶MB同工酶(CK-MB )活性变化、自由基产物（MDA）浓度及抗氧化酶活性（如SOD等）。深入研究可选择缺氧再灌注损伤通路中不同环节特异性指标进行测定观察。

【结果与分析】

1．细胞形态观察正常心肌细胞光镜下搏动有力，节律一致，形态及活力均好。缺氧／复氧可造成细胞损伤，导致搏动减弱甚至停止，局部细胞脱落。

2．细胞活力观察MTT法测定细胞存活率。以正常对照组为100%，比较模型组与药物干预组的差异。

3. CK-MB测定 CK-MB在心肌细胞分布有较高特异性，细胞膜受损导致其外溢。可分别收集培养液及细胞（经破膜剂或超声破膜后）测定培养液中及细胞内CK-MB。分别将各组缺氧2小时及复氧4小时培养液及复氧4小时后细胞裂解液，以2000r/min离心20分钟，取上清液，免疫抑制法测定CK-MB。缺氧及复氧损伤均可导致CK-MB释放增加，可以总量进行统计分析。

4. LDH测定细胞膜受损导致LDH释放，是反映细胞损伤程度常用指标。LDH在培养基中较CK-MB稳定、t1/2长，且测定更简便，试剂价格较低廉，故应用更广泛。为避免操作造成的误差，每个标本自设对照管，以两者差值为活力值。

【注意事项】

1．心肌细胞分离培养须严格无菌操作。应尽可能提高获取量并保证细胞活力，关键在于酶消化时间的掌握和纯化过程。

2．乳鼠心肌细胞耐缺氧能力高于成年鼠，有研究认为缺氧3小时以上才有明显酶学变化，研究者应根据具体情况探索适宜时间。