肺癌是造成人类最常见的癌症致死的原因之一。大部分肺癌来源于上皮组织。上皮类肺癌一般有两种类型：小细胞肺癌（SCLC，大约占肺癌的25%）和非小细胞肺癌(NSCLC，大约占肺癌的75%)。培养各种肺癌细胞有两种基本方案，一种方案是针对SCLC细胞，采用HITES基本添加物培养基（5种添加成分：氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、雌二醇和硒）可成功地对SCLC来源的肿瘤细胞进行原代培养。再加入一些因子，如铃蟾肽、霍乱毒素或血清，可刺激细胞生长；另一种方案是针对NSCLC细胞，采用不含血清的限定性培养基（C基础培养基），培养来自NSCLC组织的癌细胞。我们将首先介绍两种培养基的配制方法：

（一）培养基及试剂的配制（表7-1)

①培养基中需添加抗生素：青霉素(10ou/rnl),链霉素(l00ug/ml )、庆大霉素(5ug/ml)、两性霉素B (5 ug/ml);② HEPES储存液是1500mmo1/L, pH7.2～7.3;③胎牛血清可在原代培养之后使用，以促进培养物中NSCLC癌细胞增殖

1. HITES基础培养基的配制

(1）营养培养基制备：RPMI 1640培养基加青霉素（100U/ml)、链霉素（100ug/ml)、庆大霉素（5 ug/ml)、两性霉素B (5ug/ml) , N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液（HEPES,15mmo1/L,pH7.2)、乙醇胺（10umol/L),磷酸乙醇胺（10 umol/L)、牛血清清蛋白（BSA,2mg/ml)；

(2）用0.2 um膜过滤除菌，储存于4℃；

(3）使用前加入终浓度2mmol/L的谷氨酰胺。

2．激素和生长因子添加物的制备

(1)将氢化可的松（0.05mmo1/L)溶于95％乙醇中，若用水溶性的类似物就溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中。

(2)将胰岛素（2.5 mg/ml )溶于1 mmol/L的乙酸溶液中。

(3）将转铁蛋白（2.5mg/ml）溶于PBS中。

(4）将17-β-雌二醇(0.1 mmol/L）溶于95％乙醇中。

(5）用PBS配制10mmol/L的亚硒酸钠。

(6）用PBS溶解霍乱毒素（10 ug/ml)。

3. HITES基础培养基中附加的生长添加物

用含BSA(lmg/ml）的PBS配制铃蟾肽（1 mmol/L)。

4．配制完全HITES基础培养基

(1)使用前，将前面无菌的RPMI 1640完全培养基与各种激素和生长因子混合，终浓度如表7-1所示。

(2）如果需要可加入铃蟾肽，即用含BSA (1 mg/ml）的PBS将铃蟾肤稀释至0.1 mmol/L，加至上述培养液中使终浓度为0. umol/L。

(3)将此完全HITES基础培养基于4℃存放，至多存放1周。

5. C培养基和C改良培养基的配制

C培养基和C改良培养基的主要区别是钙的水平，C培养基是DMEM与Hem's F12的混合物（1:1)；而C改良培养基是Clonetics公司发明的一种低钙基础的（low-calcium-based)支气管上皮细胞生长培养基（binding epidermal growth factors, BEGF )。配制这些培养基，并加入抗生素、HEPES、乙醇胺、磷酸乙醇胺、谷氨酰胺、BSA等添加物，如表7-1所描述。

6．激素和生长因子添加物的制备

配制胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松／地塞米松和亚硒酸钠同上文所述。再于10m1 PBS中溶解100ug EGF(10ug/ml)，三碘甲状腺原氨酸（T3)溶于PBS(l0umol/L)。

7．牛下丘脑提取物（BHE）的制备

此物质为内皮细胞生长补充剂。也可用牛脑垂体提取物（bovine pituitary extract, BPE)替代，后者有商品化的试剂可以购买到。

(1)将100g牛下丘脑置于200m1冰冷的PBS溶液中，在4℃用搅拌器短暂匀浆大约3～6分钟。

(2）将匀浆液用2～3层粗纱布过滤，于4℃搅拌1～2小时。

(3）将匀浆液于4℃离心，20 000r/min，离心40分钟，收集上清液，加入硫酸链霉素(0.5g/ml)。

(4）将混合物于4℃再搅拌1～2小时。

(5)将混合物再次离心，20 000r/min，离心40分钟，此步骤可去除提取物中的脂类成分。

(6)将上清液用0.2 um的滤膜过滤消毒。

(7）每个管分装5 ml，于-20℃储存2～3个月。

8．配制完全C培养基和C改良培养基

于细胞培养之前，在含有抗生素、HEPES、乙醇胺、磷酸乙醇胺、谷氨酰胺、BSA等添加物的C培养基或C改良培养基（表7-1)中加入各种激素、生长因子和BHE。此完全C培养基和C改良培养基可储存于4℃，不要超过1周。

（二）肺癌细胞的分离

细胞分离时，培养基中要加入10mg/ml的BSA，以防止细胞在处理时受到损伤。BSA还可作为一种解毒剂，中和死亡的或将要死亡细胞可能释放出的毒素。我们将介绍两种细胞解离的方法，如果组织块足够大，这两种方法都可以试一试。第一种方法最为简单、快速，就是用机械研磨法简单易行，但是对细胞有一定损伤，难以去除组织中的纤维细胞杂质

第二种方法是酶消化法。

1．机械研磨法

【材料】

(1)肺肿瘤组织、培养基（根据肿瘤组织种类选择适当培养基）、Ficoll/metrizoate溶液。

(2）眼科剪刀或手术刀、眼科镊子、50目和200目不锈钢筛网、注射器、玻璃吸管、离心管、烧杯、平皿。

【方法】

(1)将肿瘤组织用无菌的剪刀或用两把手术刀交替剪切成5～10mm³的小块。

(2）用玻璃吸管反复吹打重悬组织，使肿瘤细胞可分离到培养基中。

(3) 800r/min，离心5分钟，收集肿瘤细胞，用5ml培养基重悬细胞团。

(4）加5ml Ficoll/metrizoate溶液至离心管中。将细胞悬液轻轻加在5ml Ficoll/metrizoate溶液上，不要混合。800r/min，离心10分钟。小心吸弃上层液，去除了红细胞、死细胞及其他组织碎片；然后从两种液体的界面收集细胞。

(5）将细胞用培养基稀释至10m1, 800r/min，离心5分钟。

(6）取离心沉淀，用完全HITES基础培养基、C基础培养基或C改良培养基将细胞团最终稀释到2x10⁵～1x10⁶/ml，将细胞悬液接种至25cm²培养瓶中。

2．胶原酶消化法

【材料】

同上，另外需要用MEM配制0.1％胶原酶溶液。

【方法】

(1)将肺肿瘤组织按照机械研磨法所描述的步骤将组织细切成小块（直径大约2～5mm)，浸入胶原酶溶液中，37℃水浴中消化30分钟后，用含有BSA的MEM培养基洗细胞。

(2）收集这些培养基，1500r/min，离心5分钟，用培养基将沉淀重悬浮。

(3）采用Ficoll/metrizoate溶液离心法（同机械研磨法）去除细胞碎片、红细胞及组织块等。

(4）离心后收集细胞团，用各种不同的培养基将细胞团最终稀释到2x10⁵～1x10⁶/ml,接种至25cm²培养瓶中。

【注意事项】

还有其他消化酶，如中性蛋白酶、弹性蛋白酶、膜蛋白酶、糖复合物降解酶，以及螯合物，如乙二胺四乙酸盐（EDTA)，都可用来消化组织。因为这些酶或化合物有的会产生细胞毒作用，在应用时注意消化时间不宜过长，在消化过程中可适当晃动离心管，保证组织块被充分消化。

（三）肺癌细胞的培养

1. SCLC细胞培养及冻存

【材料】

无血清HITES基础培养基（见上述培养基配制方法）、胎牛血清（FBS)、二甲基亚砜（DMSO )、冷冻管。

【方法】

(1)将解离后的细胞悬浮于无血清的HITES基础培养基，以1x10⁶/ml细胞密度接种培养皿（或瓶），置37℃,5% CO₂孵箱中培养。

(2）培养1～2周之后，大部分SCLC细胞呈“悬浮凝集状”生长，而正常细胞是黏附于培养皿生长，因此很容易辨认原代培养物是否含有SCLC细胞。通过离心（1500r/min, 5分钟）可从培养基中重新收集这些悬浮凝集细胞。

(3）如果培养物中有太多细胞碎片，可用Ficoll/metrizoate离心法重新收集活细胞。偶尔SCLC细胞也会贴在平皿表面，可轻轻敲打培养瓶使细胞离开，再重新收集这些悬浮的细胞。

(4）传代过程中一定要避免低密度接种，每次传代一般要维持（5～10)x10⁵/ml的接种密度。

(5）为了促进传代培养的细胞生长，可在HITES基础培养基中添加2％～5％的FBS。

(6）用HITES基础培养基，加10% DMSO和10％～50％的FBS，冷冻保存SCLC细胞，储存于液氮罐中。

【注意事项】

用无血清培养基代替添加血清的培养基，其基本原理是在早期生长环境中限制基质细胞的生长。但这种方法可能也会限制癌细胞的生长，所以在无血清培养基中培养几代后，要加入血清促进癌细胞的增殖。但加入血清后也会刺激细胞的终末分化，还可能是癌细胞产生一些生长因子，从而刺激成纤维细胞的生长。这种情况下，成纤维细胞的污染不可避免，可采用差速贴壁的方法来选择癌细胞。

2. NSCLC细胞培养

【材料】

C基础培养基、0.1%胰蛋白酶(PBS配制，含1 mmol/L EDTA和1％胰蛋白酶抑制物。

【方法】

(1)用C培养基将原代肿瘤细胞接种于25 cm²的培养瓶中，接种密度应为5x10⁶/ml，置37℃,5% CO₂孵箱中孵育2～4天后，大部分肿瘤细胞以及正常上皮细胞和基质细胞都黏附于培养瓶的表面。通常在初始培养时，很少有基质细胞，即使有，这些细胞也不增殖或增殖活性很低。与此相反，正常上皮细胞能够很快生长。

(2）培养1～2周后用0.1％的胰蛋白酶消化贴壁的细胞。

(3）在细胞脱落后加入等量的1%胰蛋白酶抑制物（C培养基配制），离心（1500r/min,5分钟），重新收集细胞。

(4)用新鲜的C培养基悬浮细胞团，以 1x10⁶/m1接种至培养皿或培养瓶。

(5）次日更换培养基，随后每隔一日更换培养基直至细胞汇合。

(6）将汇合的细胞传代，方法如前所述，用无血清的C培养基接种。

(7）为了去除混杂在培养物中的正常上皮细胞，可用含10% FBS的C培养基处理培养物。

(8)培养1周后可继续进行传代培养，维持在无血清的C培养基中。

【注意事项】

根据这类细胞的培养经验，可能需要增加血清处理这一步，这一步骤可在培养中保持大多数类型的腺癌和大细胞癌细胞。如果有基质细胞混杂于培养物中，建议采用下列两种方法消除：一是采用胰蛋白酶局部消化法，由于成纤维细胞比上皮细胞容易脱落，可用低浓度的胰蛋白酶溶液（<0.05%）来进行；二是采用差速贴壁法，由于成纤维细胞贴壁的速度比上皮细胞快，将细胞接种于培养皿2～6小时后，再收集尚未附着的细胞接种至一个新的培养皿中。如果还有成纤维细胞存在，就反复进行这两个步骤。