细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种由单一细胞克隆化形成的细胞群体称为细胞株，其后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，细胞株的遗传背景均一，生物学性状相同，利于对遗传、免疫及其细胞分子机制进行实验研究，也利于对不同克隆的细胞形态和功能进行比较研究，还有利于进行药物、放射线等对均一细胞作用的研究。从理论上讲，各种培养细胞都可进行克隆培养（cloning culture)。但实际上，原代细胞和有限传代的二倍体细胞比较困难；无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞则比较容易。其原因是细胞对培养环境有一个适应过程，即细胞对营养液具有同化作用，单细胞的同化能力不如群体细胞强，原代细胞和有限细胞系不如无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞强。

克隆细胞技术的关键是细胞的分离，必须保证分离出来的细胞确为1个而不是2个或更多；而分离的单一细胞在体外培养能否生长繁殖最后形成克隆，与其细胞克隆形成率（clo-ning efficiency）有关，如果细胞克隆形成率偏低（<10%）则应采取一些措施，包括：①增强细胞的同化能力（如将小牛血清改为胎牛血清、适应培养基中添加细胞刺激因子和调节C0₂浓度等）；②增强细胞的贴壁能力（如采用软琼脂或制备底层的饲养层细胞）。根据生长基质或培养物的性质或类型不同，常用的细胞克隆技术分为稀释克隆法、饲养层克隆法、胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法、琼脂克隆法等多种。

【材料】

1．细胞的制备经过原代或传代培养的细胞。

2．培养用液克隆适应培养液、Hanks液、0.125％胰蛋白酶。

3．培养用品包括直径为0.5mm，长为8mm的毛细玻璃管，培养瓶皿、培养板（24孔、96孔）、吸管、微量加样器等。

【方法】

1．稀释克隆法

（1)毛细管克隆法

1)将一定量的细胞悬液（如10⁵个／ml或更低）倍比稀释至1个／ml;

2）取l0ml稀释的细胞悬液，用直径为0.5mm，长为8mm的毛细玻璃管若干（30～50支），在负压作用下，将悬液吸入各毛细管中；

3）在倒置显微镜下检查出每管只有1个细胞的毛细管，然后放入适应性培养基或有饲养层细胞的培养瓶（皿）内，置37℃ ,5% CO₂孵箱中培养。当一个细胞在毛细管内繁殖后向管外扩展时，会形成单细胞克隆的细胞群体。

(2）有限稀释铺板法：有限稀释需将细胞悬液在一排试管中进行梯变倍数稀释，然后将稀释的细胞悬液接种于微孔培养板（也可在96孔板上直接稀释），使每孔仅含1个细胞。经镜下检测，标记下含单细胞的孔，置培养箱培养。数日后，凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞集落即为克隆细胞。

1)低密度细胞悬液的制备：选用对数生长期的状况良好的待克隆细胞，如为贴壁细胞则先用胰蛋白酶消化，使其脱离瓶壁，经反复吹打使细胞相互分离，用培养液梯变倍数稀释细胞，分别稀释成50/m1,10/m1,5/ml三种稀释度的细胞悬液。

2)接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使之混悬均匀。将三种稀释度的细胞分别用加样器接种于96孔培养板，每孔分别加100ul细胞悬液（100ul内平均细胞分别为5,1,0.5个细胞）和100ul培养液。接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发。迅速盖好盖板，置于37℃,5% C0₂的培养箱中培养。

3）标记与培养：培养6～12小时待细胞下沉并贴附于培养板孔底后，从温箱中取出培养板，置于倒置显微镜台上，观察和标记下含单个细胞的孔。以单个细胞落于孔底平坦部而周边清晰者为符合要求。然后，送回C0₂培养箱中继续培养。培养期间视其pH的变化决定是否换液或补加培养液。

4）分离扩大培养：将接种细胞培养72～96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔。先吸去旧培养液，用Hanks液洗1～2次。然后加胰蛋白酶溶液少许进行消化。置于倒置显微镜下观察，待细胞变圆时，加入0.1 ml含10％胎牛血清的培养液终止消化。用吸管轻轻吹打，当细胞脱壁悬浮后，一并吸入24孔板或另一培养瓶中，补加一定量培养液，置C0₂培养箱中扩大培养。待形成新的细胞群体后，即转用常规培养法培养。

2．饲养层克隆法分离的单个细胞和密度极低的分散细胞很难存活和增殖，为了促使刚刚克隆化的极少量细胞生长繁殖，常采用“饲养细胞（feeder cell)”促进克隆细胞的增殖。常用的饲养层细胞有成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞等。

(1)饲养层的制备：取人或动物胚胎成纤维细胞，待细胞生长至旺盛的对数生长期时，用60Coγ射线以40～60Gy单次照射细胞，亦可在培养基内加入0.25ng/ml丝裂霉素C(终浓度为10⁶ mol/L )处理16小时后，其目的是使细胞丧失有丝分裂能力，但仍可短期存活，有代谢功能，不仅可维持pH值而且还可为克隆细胞提供必要的养分及其刺激生长因子。将饲养层细胞制备成细胞悬液，接种入培养皿中，培养24～48小时，便可直接作饲养细胞之用。

(2）接种细胞：先将经60Coγ射线照射过的饲养细胞准备好待用；然后取生长至指数增生期的用作克隆的细胞，经胰蛋白酶消化后制备成细胞悬液，细胞计数并将其稀释成20～200/ml;弃掉饲养细胞瓶内培养液，注入稀释的待克隆细胞悬液。做饲细胞层克隆细胞时，还应设对照组，对照组中只接种待克隆细胞悬液，没有饲细胞层。

(3）克隆形成：将待克隆的细胞悬液接种到饲养细胞层后，培养2～3周，每周换液一次，待克隆出现后，或分离，或计算克隆形成率。

3．胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法原代培养细胞容易黏附于胶原膜层或血纤维蛋白膜层等生长基质成分之上。在细胞克隆中，用胶原膜层或血纤维蛋白膜层代替饲养细胞，可帮助单个细胞和密度极低的分散细胞都附着贴壁、存活并逐渐繁殖。以血纤维蛋白膜层板为例介绍细胞克隆技术。

(1)血纤维蛋白膜层的制备

1)取0.2ug凝血酶溶于l00ml克隆培养液中，制成A液；另取250mg牛血纤维蛋白原，800mg NaCl和25 mg枸橼酸钠，共溶于l000ml重蒸水中，制成B液。

2)取B液1ml和A液4ml，放入培养皿内尽快混合，几分钟后即形成透明胶层。

(2）消化、接种和培养待克隆细胞

1)取处于对数生长期的培养细胞，用胰蛋白酶溶液消化后制备细胞悬液。

2)用培养液稀释细胞悬液，一般以每一培养器皿内生长1～10个克隆的细胞浓度为最适。例如，克隆效应为5％～10％时，则一个器皿内接种100个细胞为宜。

3）将细胞悬液按所需数目种入铺有生物基质层的培养器皿内，于C0₂培养箱中培养。每周换培养液1次。

(3)观察并计数克隆之数目：几周后可见有由500～1000个细胞形成的群落。

4．软琼脂克隆分离法琼脂层是一种简单的生长基质层，可帮助细胞贴附生长。但琼脂中含有酸性硫酸多糖，对大多数细胞有一定的抑制作用。对于正常贴壁细胞在软琼脂中不能形成克隆，本法仅适于悬浮培养的淋巴细胞或恶性程度高的贴壁细胞。目前多用半固体培养基克隆方法。

(1)制备细胞悬液：将对数生长期细胞制成单个细胞悬液（贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化，使之分散成单个细胞），做活细胞计数，调整细胞密度至（1～5)×10⁴个细胞／L。

(2）制备底层琼脂：取5％琼脂置沸水浴中使琼脂完全溶化，取出1份5％琼脂移入小烧杯中，待冷却至50℃，迅速加入9份预温37℃的新鲜培养液（即成为0.5％琼脂），均匀后立即浇入24孔培养板中，每孔含0.5％琼脂培养基0. 8ml，置室温使琼脂凝固备用（此层也可以省略）。

(3)制备上层琼脂：取37℃保温的不同密度的细胞悬液9.4ml移入小烧杯中，加入50℃的5%琼脂0.6ml，迅速混匀，即配成0.3％琼脂培养基，立即浇入铺有（或无）底层琼脂的24孔培养板中，每孔加0.8 ml，置室温使琼脂凝固。每孔细胞数量可根据细胞生长速度和实验目的来确定。一般可调整每孔含25,50和100个细胞的梯度密度。

(4)培养与观察：培养板于37℃ ,5% CO₂的培养箱中培养1～2周或更长，若需培养更长时间，每孔可补加0.8ml含琼脂的培养液，注意观察培养液的颜色变化和有无明显集落形成，培养液变酸要及时换液，集落形成要计数克隆数或取克隆细胞扩大增殖。

【结果及注意事项】

1．观察结果并集落（克隆）计数在倒置显微镜下观察结果，计数直径大于75 um或含有50个细胞以上的集落。经培养后能够增殖形成克隆的百分率称集落（克隆）形成率( cloning efficiency)，以下述公式计算。

2．克隆形成率与接种细胞的密度有一定的相关性。细胞悬液的细胞密度越大，接种时每平方厘米培养皿上接种的细胞越多，克隆的形成率就越低。为提高克隆形成率，须将细胞悬液稀释成密度为10/ml，甚至更低，接种的密度也要小。见表3-2。

3．细胞克隆形成率低于10％应采取增强细胞同化能力的措施。如①选定克隆形成效率比较高的培养液作为最适的克隆化培养液；②用胎牛血清作培养液中的血清成分，比小牛血清优越；③调控C0₂浓度，C0₂可提高绝大多数细胞克隆形成率，常用5％浓度。对有的细胞，如人成纤维细胞和神经胶质细胞克隆时，2％的C0₂效果可能更好。HEPES (20mmol/L )与2％的C0₂配合使用能很好缓冲培养液pH值的波动，使细胞尽量少受这一因素的影响。

适应培养基中加入添加细胞刺激因子，某些激素（如胰岛素、地塞米松等）和生长因子有促进细胞克隆形成的作用。含1～lOIU/ml胰岛素的培养液对许多种细胞的克隆形成均有促进作用。地塞米松也能提高人正常神经胶质细胞、神经胶质瘤细胞、成纤维细胞、黑色素瘤细胞等的克隆形成率。而表皮生长因子可促进角质细胞、成纤维细胞和软骨细胞等生长，推荐使用浓度为1～20ng/ml。

4．饲养细胞在体外培养时，单个细胞和密度极低的分散细胞很难存活和逐渐繁殖。饲养细胞为克隆细胞创造了适宜生长的微环境。饲养细胞也称滋养细胞，是一层经过射线照射处理的、供其他细胞附着的细胞层。饲养细胞受射线照射后，失去其分裂能力，但仍存活并有同化营养液的能力，待克隆的细胞散落在饲养细胞上层并与之接触。细胞克隆形成后，饲养细胞逐渐死亡，换液时可被清除。

5．增强细胞的贴壁能力以促进细胞克隆形成一种简单的生长基质层是琼脂层，常用浓度为2%。琼脂层制备后，可把细胞接种在琼脂层上。恶变细胞或恶性转化细胞在软琼脂(1.2%）中的生长，与在裸鼠体内的致瘤性有很大一致性。因此测试细胞能否在软琼脂中生长，已成为测试转化细胞恶性的重要指标。原代培养的细胞易贴附于胶原层或血浆纤维蛋白层生长基质上。用多聚右旋赖氨酸（poyrylysine）包被培养瓶、培养皿底壁，能提高用低血清培养的人成纤维细胞克隆形成率。其包被方法是：①配制浓度为1mg/ml的多聚右旋赖氨酸水溶液，用以湿润培养瓶底；②倒出多聚赖氨酸溶液，用5m1 PBS冲洗培养瓶皿1次后，即可立即使用。用培养液配制的浓度为5 ug/ml的纤维粘连蛋白（fibronectin )处理培养瓶后亦有类似效应。