电诱导细胞融合（electrofusion of cell)是20世纪80年代发展起来的一项细胞工程技术。该技术的机制比较清楚，电诱导首先使细胞在电场中极化成偶极子，并沿电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜，从而导致细胞融合，其细胞融合过程具有易控制，融合频率高，无毒性等优点。

【材料】

1．组织来源及细胞BALB/C小鼠，SP2/0骨髓瘤细胞。

2．试剂

(1)脉冲缓冲液（PM)：用于洗涤B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，以及作为加交流、直流电场时的介质。PM液含蔗糖280mmol/L,醋酸镁0.5mmo1/L,醋酸钙0.1 mmol/L，用电阻率大于106Ω·cm的三蒸水配制。高压灭菌，4℃下保存备用。

(2）融合后液（PMF)：用于电穿孔后使孔洞完善化。含NaCl 132mmol/L,KCl 8mmol/L,NaH₂P0₄4mmol/L,Na₂HP0₄ 6mmol/L,醋酸镁0.5mmo1/L,醋酸钙0.1 mmol/L，用电阻率大于106Ω·cm的三蒸水配制，高压灭菌，4℃下保存备用。

3．培养基 HAT培养基、RPMI 1640培养基。

4．仪器及器具细胞电融合仪、离心管、吸管、恒温箱与水浴锅、普通离心机、低温高速离心机、普通显微镜、相差显微镜、超净工作台、C0₂培养箱、96孔和24孔培养板、200目不锈钢纱网等。

【方法】

1．细胞的准备

(1) SP2/0骨髓瘤细胞：融合前1天将实验所用SP2/0骨髓瘤细胞传代，使实验时骨髓瘤细胞处于对数生长期。将该细胞收集于离心管中，以1000r/min离心8分钟。弃上清液，加10m1无血清的RPMI 1640培养液，将沉淀细胞悬浮备用。

(2）淋巴细胞：实验用淋巴细胞取自经3次用目的抗原免疫的BALB/C小鼠脾脏，每次免疫间隔2～3周，最后一次免疫后3～4天，将小鼠处死，取出脾脏，加10ml无血清的RPMI1640培养液，将细胞用200目不锈钢纱网研磨分散，制成细胞悬液。以1000r/min离心8分钟，弃上清液，用培养液洗涤1次。加入10ml无血清的RPMI 1640培养液，将细胞重新悬浮，备用。

(3）饲养细胞：融合后培养所用的饲养细胞，取自健康的BALB/C小鼠腹腔中的巨噬细胞。融合前，将收集的巨噬细胞悬液以1000r/min离心8分钟，弃上清液。加入25 ml HAT选择培养液，混匀。分别接种到24孔或96孔培养板中。经培养后形成的饲养层细胞，可用以辅助新的融合细胞的生长。

2．细胞融合

(1)将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按1:5比例混合，细胞密度为1.5×10⁷个／ml，细胞悬液以1000r/min离心8分钟，将细胞沉淀用PM液洗2次。

(2）将沉淀的细胞重新悬浮后注入电极小池。然后施加如下电场条件：电解质电泳的交流电场频率为1 MHz，振幅为250 V/cm，施加30秒。在显微镜下观察，当可以看到80％以上细胞已形成珠串时，立即加穿孔电脉冲。其参数为，脉冲幅度5kV/cm，时间常数20ms，脉冲个数5，间隔1秒。

(3)室温下静置10分钟。再用总量为5 ml的PMF液将融合后的细胞冲洗取出。于37℃下温育20分钟。

(4)以1000r/min离心8分钟。给细胞沉淀加入25m1 HAT选择培养液，混匀。分别接种到24孔或96孔培养板内，置37℃ C02培养箱中培养12～24小时。

3.筛选细胞融合后12～24小时，将细胞接种到选择HAT培养基中，细胞密度在60％～80％汇合率之间，容许细胞进一步生长，进行异核体筛选，4～14天后可观察到大集落的杂交瘤细胞克隆。

【结果】

培养3～5天即可见小克隆出现，杂交细胞较大，呈圆形且透明，其他细胞透光性差并逐渐死亡。当培养8～12天，克隆可长至孔底面积的30％～50%，此时可取培养上清液进行抗体检测。一旦检测到分泌预定抗体的克隆，应及时将阳性克隆转种24孔培养板进行扩大培养。