电镜利用波长极短的电子束为光源，其分辨率可达2～2.5A(0.2～0.25 nm )，比光镜高1000倍，比肉眼高100万倍。随着电镜技术的不断进步，现已有诸多电镜技术，如透射电镜超薄切片技术、扫描电镜样品制备技术、电镜细胞化学技术、电镜免疫细胞化学技术等。其中，透射电子显微镜和扫描电子显微镜应用最广。

（一）透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）技术

透射电子显微镜是发展最早、应用最广的电子显微镜。特点是利用电子束穿透样品获得样品的电子信号，经多级电子放大后成像于荧光屏，适用于观察组织、细胞内部的超微结构，观察蛋白质、核酸等生物大分子及病毒的形态结构。由于电子束的穿透能力一般很弱，因此观察的样品必须很薄（约50～80um )，常用超薄切片法、冷冻超薄切片法和冷冻复型法制备透射电子显微镜样品。透射电子显微镜的分辨率为0.1～0.3nm，加速电压为20～220V，放大倍数为500～500000。超薄切片技术大致分为取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等几个步骤。

［成像原理］

有热阴极发射的电子，在几十至几百千伏加速电压作用下，经聚光镜聚焦成束，以较高速度投射到很薄的样品上，并在与样品中的原子发生碰撞时，改变方向，产生立体角发散。散射角的大小与样品的密度和有关：质量、厚度越大者，电子散射角也越大，通过的电子被样品后面小孔径光栏挡住的就越多，像的亮度就越暗；质量、厚度越小者，电子散射角亦较小，通过光栏电子束较强则，则成像的亮度较大。因此，对于不同质量、厚度的物质，在荧光屏上就形成明暗不同的黑白影像。

1．超薄切片法

【材料】

(1)样品制备所需器材与制剂；

(2）待观察的培养细胞：贴壁细胞经消化制成细胞悬液，或悬浮培养细胞，细胞量约10⁶～10⁷个细胞。

【方法】

(1)取材：根据实验的目的和要求不同选择适当的取材方法，对悬浮细胞或单层生长的贴壁细胞，欲观察其内部微结构，则选用离心法制备样品；若对贴壁细胞想观察其细胞的连接，要选用原位取材法。

1)离心法：取对数生长期的单层贴壁细胞，弃去瓶中的培养液，用市售的细胞刮（也可自制橡胶细胞刮）刮下单层细胞，或用低浓度胰蛋白酶消化，用吸管将细胞移入l0ml锥形离心管中。为防止细胞的自溶，要求在0～4℃条件下操作，以降低酶的活性。加4℃预冷的0.0l mol/L PBS (pH 7.2）至l0ml，并用吸管将细胞轻轻吹打均匀，用2000r/min离心20分钟，吸尽上清液，置冰浴杯中备用。

2)原位法：预先在培养瓶（皿）内加入玻璃盖片或聚苯乙烯盖片，接种细胞后置C0₂孵箱培养，细胞慢慢贴壁于瓶底和盖片上，待细胞汇合形成单层时，无菌取出盖片，用0.Olmol/L PBS (pH 7.2）漂洗后备用。

(2）固定：固定是为保持被研究细胞的精细结构和化学组成在分子水平上同生前细胞一样，并为防止细胞在脱水至包埋过程中丢失或增加某些成分。取离心管倾斜一定角度放在架子上，用吸管沿管壁缓慢加入4℃预冷的固定液（如2％戊二醛4ml，加固定液时一定要注意不能冲散细胞团块），置4℃冰箱内固定30～120分钟。取出后用探针剥离细胞团块，移入小试管内置冰浴中，用4℃预冷的PBS漂洗3次，每次10分钟；再用1％四氧化锇在4℃固定15～30分钟，接着用4℃预冷的PBS漂洗3次。细胞盖片按相同方法在小玻璃瓶内进行固定。

常用的固定液有：

1)戊二醛( glutaraldehyde, CS5H802 )：戊二醛对细胞结构有较强的亲和力，能很好地保存细微结构、某些酶活性和糖原，但不能提供电子反差。经戊二醛固定后，标本中的脂类仍易被溶解、洗脱，故一般只用作前固定剂。使用浓度为2.5％～5.0% (0.1mol/L磷酸缓冲液配制）。固定时间为30分钟至数小时。

2)四氧化锇( osmium tetroxide Os04 )：四氧化锇是一种强氧化剂，毒性极大，要在毒气柜中进行操作。对氮有较强的亲和力，对含蛋白质和脂肪物质以及磷脂蛋白的膜结构有良好的保存作用，但对糖原、核酸的固定效果较差。同时，由于四氧化锇的质量密度大，故能产生良好的电子反差。用四氧化锇固定的组织不易变硬和变脆，便于超薄切片。四氧化锇一般用0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成1％的溶液，用作与戊二醛双固定时的后固定剂。固定时间为30分钟至2小时。

3）高锰酸钾（potassium permanganate, KMn04)：高锰酸钾也是一种强氧化剂，对磷脂蛋白等有良好的固定作用，可用以保存细胞膜的结构，对神经髓质的固定效果最好。

4）甲醛、多聚甲醛：具有较大的渗透力。一般用作双固定剂的前固定剂。

(3）脱水：用脱水剂将已固定细胞内的游离水除去，以利于包埋剂均匀地渗透到细胞内。常用的脱水剂有乙醇、丙酮等。以丙酮为例，用系列丙酮在室温下脱水。通常先以50%和70％丙酮溶液各脱水1次，每次10分钟；90％丙酮溶液脱水2次，每次10分钟，最后用100％丙酮溶液脱水3次，每次10分钟。脱水时最好在一天内依次完成，必须过夜时，可放在70％脱水剂中置冰箱内保存。

(4)浸透：吸尽瓶内脱水剂，加3 ml纯丙酮-Epon 812包埋剂（体积比为1:1)，室温下放置30分钟后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1 ml，室温放置2小时或过夜。

(5)包埋：将脱水后的细胞团块浸透包埋剂，然后用混合包埋剂包埋在胶囊中处理。常用的包埋剂为环氧树脂，如国产的618与进口的Epon 812,815等。配制混合包埋剂时，需加硬化剂十二烯基琥珀酸酐(dodecenyl-succinic anhydride, DDSA）和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐(methyl nadic anhydride, MNA )。为了防止包埋块变脆，还应加增韧剂，常用的有邻苯二甲酸二丁酯( dibutylphthalate, DBP)。另外，还使用加速剂加快硬化的速度。常用的加速剂为2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚(2 ,4 ,6 tri-(dimethyl aminomethyl)-phenol, DMP-30 )。常用的包埋剂的用量和配方列于表2-2。

1)细胞团块的包埋：吸取混合包埋剂，滴2滴于2号胶囊模块孔的底部，然后将细胞团块移入胶囊底部中心，注满混合包埋剂，放60℃烤箱烘烤24小时，使之固化成硬块。

2）细胞盖片的包埋：将预先干燥的明胶囊注满混合包埋剂，倒盖在单层细胞上，在60℃固化24小时。聚苯乙烯盖片与包埋剂性质不同，容易用手将盖片与包埋块分离；玻璃盖片与包埋块不易分离，此时可将它们一同投入盛有液氮的烧杯中片刻，然后迅速取出放入自来水中，两者可立刻分开。

(6)修块：切片前应先粗修包埋块，先将包埋块安装在特制的夹具上，在组织显微镜下用单刃刀片切去多余的包埋剂，暴露细胞团块表面。原位包埋块不需要修正表面。然后在细胞团块四周边以45。切去多余的包埋剂，并做记号，以便定位。

（7）制备半薄切片：

1)切片：将修好的包埋块固定于超薄切片机的刀架上，切取厚度约1000nm的半薄切片。

2）染色：取洁净载玻片，浸入1％明胶和1％铬明矾混合液中，取出放在烤片机上加热至60℃使之干燥。在玻片上滴加1滴蒸馏水，用镊子将半薄切片移入水滴中，再放在烤片机上加热，使之展平干燥。然后滴加亚甲蓝染液于60℃染色30秒，用水冲洗，再滴加1:1的0.25％硼酸钠和0.5％碱性复红，60℃染色10秒，水洗，烤干。

3）镜检及定位：在显微镜下观察半薄切片的细胞图像，确定欲作超薄切片的部位并做标记。

(8）制备超薄切片：

1)清洗载网：常用直径3 mm ,150～200目的铜网，用清洗液洗净，用无水乙醇脱水干燥。

2）制备支持膜：用氯仿配制0.45％的Formvar溶液，将干净载玻片垂直浸入该溶液中，即刻取出，玻片表面即形成一层薄膜。用刀片划开薄膜四周，浸入盛满水的水槽中使薄膜与玻片分开。将铜网小心放在薄膜上，并将封口膜覆盖其上，一并将铜网和支持膜取出。

3）制备三角形玻璃刀：备刀是超薄切片的重要环节。超薄切片刀有钻石刀和玻璃刀两种，钻石刀质硬耐用，可以直接购置；玻璃刀需用专门制刀玻璃放在制刀机上精心制备。

4）制备超薄切片：在超薄切片机上安装玻璃刀，固定包埋块，调整刀距，切取50～100nm厚度的超薄切片，要求没有刀痕和震颤，平整而均匀。用睫毛笔挑选切片，并用钢网环套取切片，将超薄切片放到具有支持膜的铜网上，保存在干燥器皿中，待染色。

(9)电子染色（以正染法为例）：电镜观察时，切片需要具有一定的反差，故常用重金属盐染色。重金属盐能与细胞结构结合，并对电子具有较强的散射力，呈暗像，反之则成明像。常用的重金属盐有醋酸铀和枸橼酸铅等。

1)将载有切片的铜网垂直夹于橡胶板上并放入平皿内，在切片一侧滴加1滴醋酸双氧铀染色液，加盖，室温下染15～30分钟；

2）取出橡胶板，用双蒸水冲洗切片，并用滤纸吸干，放入平皿内，滴加铅染液（含醋酸铅、硝酸铅和枸橼酸铅）染色时用枸橼酸铅饱和水溶液染色15～30分钟，用双蒸水漂洗，干燥，观察。

【结果】

电镜观察：按说明书要求安装超薄切片，调试电镜，观察细胞超微图像，选择观察视野和放大倍数，摄像。

2．冷冻超薄切片法冷冻超薄切片技术是为在分子水平上研究细胞的超微结构，以保存其可溶性物质和生物大分子的活性。

【材料与制备方法】

(1)取材和固定：取1 mm3组织块，在0.l mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5％戊二醛溶液中固定1小时，再用明胶、羧甲基纤维素或牛血清清蛋白等分子量较大的物质浸人包埋，以利切出面积较大而平整的切片。

(2)修块：在冷冻前，将标本浸人20％～30％甘油内进行冷冻保护处理，并修好组织块。

(3）冷冻：将组织块放在样品架上，人液氮中决速冷冻。

(4）切片：生物组织一般在-100～-80℃比较好切，刀温保持在略高于组织块的10～20℃为宜。刀槽内盛有60％的二甲亚砜水溶液，使刀片漂浮于液面上。然后蘸取在铜网上。

(5)染色：同样可用铀、铅进行正染，但更多采用简便、快速和利于保存结构的负染法。常用的负染剂有磷钨酸和硅钨酸。一般染色数秒至1～2分钟，干燥，观察。

【结果】

与普通电镜照片相反，在负染照片上越是厚重、致密的物体，越是透明；越是疏松的物体，则越发暗。

3．冷冻复型法将标本迅速冻至-190℃以下，与真空喷镀仪中断裂、加温使冰升华后，在标本断裂面45。方向喷铂，以增加表面反差，再于90。方向喷碳成膜。然后分离出复型膜置于铜网上，以待观察。这种方法称为冷冻蚀刻（freeze-etching)。如果不经加温升华而直接喷铂、喷碳制成复型膜，则为冷冻断裂（freeze-fracture或freeze-cleaving )。通过复型膜可观察到断裂面上的许多立体影像，而经过蚀刻的标本还可以看到生物膜断裂的内、外表面。

【材料与制备方法】

(1)取材：将标本切成3mm×3mm×(1～1.5)mm小块，放人预冷的2.5％戊二醛溶液中固定1～3小时，冰箱中固定。

(2)固定：组织块在0.1 mol/L (pH 7.2～7.4)磷酸盐缓冲液中反复洗涤0.5～1小时，放人含有30％甘油的生理盐水中8～24小时，4℃冰箱保存。

(3）冷冻断裂：将标本放人液氮中速冻（在0.1～0.2秒内冷至-190℃以下），复型切断装置也同时放人液氮冷却。然后把标本放人与复型切断装置同时冷却的样品杯中，再将样品杯嵌人样品座的杯槽内，刀台亦在样品座上，再次将复型切断装置放人液氮中使标本冷冻。冷冻后提出复型切断装置放人真空喷镀仪中，于真空度（1×10^-5）-（5×10^-5) mmHg、样品温度-110～-100℃是进行断裂。

(4）蚀刻：蚀刻是指样品慢慢加温，使冰升华而暴露出膜的内、外表面的过程。蚀刻的速度与温度和真空度有关。真空度在10-5 mmHg以下、温度在-100～-96℃时，冰晶升华，进行蚀刻最好。

(5)喷镀：样品断裂蚀刻后，先从45。方向喷铂，再于90。方向喷碳，以增加反差并使复型膜的图像更具有立体感。

(6)复型膜的分离和捞取：将经断裂并喷铂、喷碳的样品放人双蒸水内，用滴管向样品周围滴人10％次氯酸钠（NaCIO)。待样品周围逐渐冒出气泡，复型膜便逐渐与样品分离、脱落。将复型膜吸出放入新鲜蒸馏水内，洗涤两次。再置于40％丙酮内，然后将膜取出，轻轻放在蒸馏水表面，用铜网捞取复型膜，干燥后即可在透射电镜下观察。

【结果】

先打开电源，抽真空，待达到设定的真空度后，调节照明系统（电子枪＋聚光镜）合轴，然后放入样品，进行加速高压选择、物镜光阑选择、观察区域选择、放大倍数选择、图像聚焦、观察及拍照记录。通过复型膜可观察到断裂面上的许多立体影像，而经过蚀刻的标本还可以看到生物膜断裂的内、外表面。观察完成后，取出样品，关机。

包埋剂在使用前数小时内配制，并要搅拌30～60分钟，使之混合均匀，避免受潮。因本配方黏度较大，搅拌后易发生气泡，可在60℃温箱中加热半小时将气泡逐出，即可使用。