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微囊藻毒素免疫检测法

发布时间:2017-03-09 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:927

1960年,Yalow和Berson最开始使用免疫检测分析血液中的胰岛素,之后这种方法被广泛地应用于医药化学分析领域。免疫检测法的基础是通过抗原抗体的特异性反应,来识别和检测各种毒素。酶联免疫吸附法(ELISA)是应用广泛的免疫检测法。根据原理的不同,ELISA可以分成间接ELISA (Indrect ELISA )、竞争性ELISA (Competitive ELISA).直接ELISA(Sandwich ELISA)。

自20世纪80年代开始,ELISA开始应用于环境中微囊藻毒素的检测。目前己经开发了基于3种ELISA原理的微囊藻毒素免疫检测法。ELISA法的优点:分析速度快,最快1.5 h即可完成实验;分析通量大,采用96孔板开展96个样品同时分析;具有较高的灵敏度,可达0.1 ug/L,无需对水样进行浓缩,直接分析。ELISA法的缺点:不能有效地鉴别微囊藻毒素分子结构;会发生交叉反应,所得到的结果往往不是单独一种微囊藻毒素的浓度,而是多种微囊藻毒素浓度之和。

竞争性酶联免疫检测是微囊藻毒素免疫分析中最常用的方法,可分为间接竞争性ELISA和直接竞争性ELISA检测两种方法。《水中微囊藻毒素的测定》(GB/T 20466-2006)规定了间接竞争性ELISA测定水中微囊藻毒素。其基本过程:水中的微囊藻毒素经离心或过滤处理后与一定量的特异性抗体反应,多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合;加入酶标记物和底物显色,与标准微囊藻毒素比较,计算水体中微囊藻毒素的含量。另外还有基于直接竞争性ELISA方法的商品化试剂盒,其基本过程:先将微囊藻毒素抗体固定在酶标板上,使用时加入经离心或过滤处理后的水样和定量的MC-LR-HRP偶联物竞争性结合酶标板上的微囊藻毒素抗体,最后加入显色底物后,显色测定;用不同浓度的标准毒素MC-LR作标准曲线,根据底物的显色程度与标准曲线作比较,可求出毒素的含量。

生物毒理学法

生物毒理学法是最早采用的微囊藻毒素分析法之一,通常采用动物口服或注射来间接衡量藻毒素的毒性,毒性强弱用半致死剂量(LD50,ug/kg)衡量。小鼠实验是比较常用的毒性分析法,通常用纯化的微囊藻毒素或水华蓝藻中粗提藻毒素,进行小鼠腹腔注射或口腔灌喂来检测藻毒素的毒性。大部分的微囊藻毒素的LD50在几十至几百ug/kg之间。此外,各种水生植物也用于检测水环境中的微囊藻毒素,有报道称两种植物Sinapis alba和Solanumtuberosum对微囊藻毒素较敏感,可以用来检测微囊藻毒素的存在。此类方法的优点是操作简单,能直观地反映微囊藻毒素的总体毒性,而且可以监测到过去未曾发现的新毒素;缺点是一般无法准确定量,灵敏度较差,无法确定毒素类型及结构,毒素消耗量大,需要大量的动物试验品。

生物化学法

微囊藻毒素可通过与蛋白磷酸酶1和2A的丝氨酸Ser和苏氨酸Thr的结合作用而影响蛋白磷酸酶活性。根据这一特性,Holmes首次提出了可以通过微囊藻毒素对蛋白磷酸酶活性的抑制程度来检测微囊藻毒素。这类检测方法称为蛋白磷酸酶抑制检测技术(Protein phosphatase inhibition assay, PPIA )。由于PPIA针对的是毒素的功能而不是结构,所得结果反映了具有相同功能的毒素的总量,而不是某一种毒素的量,因此所测物质是微囊藻毒素类物质,一般以MC-LR当量作为测定结果。PPIA可定量测定水样中微囊藻毒素,检测灵敏度可达0.5~1.57 ug/L. PPIA的优点是反映各种毒素的总量,检测灵敏度高而且测定时间较短、干扰较小,灵敏度高;缺点是该方法特异性稍差,不能区分不同结构的微囊藻毒素,需要制备放射性底物。

目前有以下几种PPIA方法。最常见的PPIA是以32p标记的糖原磷酸化酶a为底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PPI和PP2A水解,而PPI和PP2A又可被微囊藻毒素抑制,因此在微囊藻毒素、蛋白磷酸酶糖原磷酸化酶反应中,根据蛋白磷酸酶水解糖原磷酸化酶a释放出32P的量就可计算出微囊藻毒素含量。第二种是有以硝基苯酚磷酸酯(pNPP)作为底物的磷酸酶抑制比色监测技术,根据pNPP被水解后产生的有色产物的多少来确定毒素的量。第三种是让未标记的被测毒素和125I标记的微囊藻毒素一起与PP2A进行竞争结合反应,达平衡后进行凝胶过滤,使与PP2A结合的毒素和未与PP2A结合的毒素分离,通过测定125 I-MCs-PP2A放射性确定微囊藻毒素的含量。

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