7 酶联免疫测定

检查试剂盒中所有试剂是否齐全完好（参见附录A）。控制室温至20°C〜24°C，取出足够数量的微孔条插入微孔架中，加入20μL的标准液和处理好的样品到各自的微孔底部，记录各标准液和样品的位置，标准和样品做2个平行实验。每个微孔中加入50μL稀释后的己烯雌酚抗体，微旋振荡混合，置2°C〜8°C冰箱中孵育20h。

取出微孔架，回复到室温20°C〜24°C，洗板（甩出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上每行拍打3次，以保证完全除去孔中的液体。用250μL蒸馅水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作2次），加入50μL稀释的酶标记物到微孔底部，微旋振荡充分混合后，置室温孵育1h，再洗板后（同上述洗板方法），每个微孔中加入50μL基质和50μL发色试剂，充分混合，并在室温暗处孵育30min，每个微孔中再加入100μL反应停止液，混合后在60min内测量并记录每个微孔450nm处的吸光度值。

8 结果计算

8.1 计算相对吸光度值

计算每个己烯雌酚标准液和样液的平均吸光度值，按式（1）求出己烯雌酚标准液和样液的相对吸光度值。

式中：

Ri——相对吸光度值，单位为百分率（%）；

Ao——空白标准的吸光度值；

Ai——标准或样品的平均吸光度值。

8.2 绘制校正曲线

以计算的标准液相对吸光度值为纵坐标、以己烯雌酚浓度的对数为横坐标，绘制岀己烯雌酚标准液相对吸光度值与己烯雌酚浓度的校正曲线（参见附录B），校正曲线在0.05μg/L~0.4μg/L范围内应当成为线性，相对应每一个样品的己烯雌酚浓度可以从校正曲线上读出。每次试验均应重新绘制校正曲线。

8.3 结果计算

在8.2绘制的校正曲线上读出的相对应每一个样品的己烯雌酚浓度乘以相对应的稀释系数（本标准所釆用的稀释系数为4），即为试样中的己烯雌酚残留量。

9 检测限、回收率

9.1 检测限

本方法的检测限为0.6μg/kg。

9.2 回收率

本方法的回收率≥70%。

附录A

(资料性附录)

己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒

A. 1 己烯雌酚酶联免疫定置测定试剂盒

己烯雌酚测定试剂盒由德国R-Biopharm公司制造，可用于肌肉、尿、胆汁、粪便及肝脏中的己烯雌酚残留检测。试剂盒应保存在2°C〜8°C的干燥避光环境中，并在有效期内使用，试剂变质应当弃掉。所有试剂应达到室温20°C〜24°C后使用。每个试剂盒包括：

IX框架，96孔板（12条X8孔）包被有兔抗己烯雌酚的抗体（兔IgG抗体）。

6X标准液（1. 3 mL/瓶），为40%的己烯雌酚甲醇水溶液：0μg/L、0. 025μg/L、0. 05μg/L、0. 1μg/L、0. 2μg/L 、0. 4μg/L。

IX己烯雌酚过氧化物酶标记物浓缩液(0. 7 mL)。

IX己烯雌酚抗体浓缩液(0.7 mL)。

IX酶基质(7 mL)：含有过氧化服。

IX发色剂(7 mL)：四甲基联苯胺。

IX反应停止液(14 mL)： 1 mol/L硫酸。

IX缓冲液(25 mL)

A. 2 己烯雌酶酶标记物的稀释

用试剂盒提供的缓冲液以1：11的比例，在玻璃试管中稀释酶标记物浓缩液，轻轻地振摇，充分混匀后使用（由于稀释的酶标记物稳定性不好，所以只稀释实际需用量的酶标记物）。

A.3 己烯雌酚抗体的稀释

用试剂盒提供的缓冲液以1：11的比例，在玻璃试管中稀释抗体浓缩液，轻轻地振摇，充分混匀后使 用(由于稀释的抗体稳定性不好,所以只稀释实际需用量的抗体)。

文章来源：《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》

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