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6 测定步骤
6.1 样品预处理
取水产品可食部分,切为不大于0.5cmX0.5cmX0.5cm的小块后混匀,充分匀浆,冷冻保存备用。
6.2 提取
称取样品5 g(精确至0. 01 g)于50 mL具塞离心管中,加入100μL内标工作溶液,再加入5 mL乙酸 钠缓冲溶液(4. 8),均质1 min后,加入10 mL乙腈,涡旋混合1 min,超声提取15 min。取出离心管, 10 000 r/mm4°C离心10 min,上清液倒入另一 50 mL具塞离心管中。残渣中加入10 mL乙腈,按上述方 法再提取一次,上清液合并于50 mL离心管中。
注:均质机清洗方法,先用大量水浸洗,再用乙腈浸洗,最后用蒸馏水浸洗。
6.3 脱脂
向盛装上清液的离心管中加入10 mL正己烷,加塞剧烈振荡1 min〜2 min, 10 000 r/min 4 °C离心 5 mm,用滴管吸弃上层正己烷层。再加入10 mL正己烷,按上述方法重复洗涤一次,所得溶液转移至鸡心瓶,加入0. 5 mL正丙醇,摇匀,于45°C水浴条件下减压旋转蒸发至干。
残渣中加入1 mL乙腈,超声波清洗瓶壁1 min后,用5 mL注射器吸取,重复上述操作,合并乙腈至5mL注射器,用针头过滤器经有机系滤膜过滤至10 mL具塞刻度玻璃管中,加水至10 mL,涡旋混匀。
6.4 C18柱净化
C18固相萃取柱,顺序用6 mL甲醇、3 mL乙酸溶液(4. 9)和3 mL水清洗并活化,弃掉洗涤液。吸取 待测溶液(6. 3)过柱,弃掉流出液。用3mL水洗涤C18柱,弃掉流出液。再用9 mL乙腈洗脱,将洗脱液接 收至10 mL玻璃管中,于50°C下氮气吹至约1 mL,用滴管吸至样品反应瓶中,用0. 5 mL乙腈洗玻璃管, 合并至同一样品反应瓶中,氮气吹干,应防潮。
注:以上步骤应连续做完,不应让吸附剂变干,过柱的流速保持1 mL/min~2 mL/min。
6.5 衍生化
6.5.1 试样的衍生化
向吹干的残留物中准确加入100μL衍生化试剂(4.14),盖紧塞子并涡旋混合1 min,在60°C烘箱中 反应30 min,冷却至室温,于48 h内进行气相色谱-质谱分析。
6.5.2 标准溶液的衍生化
吸取一定量的β-雌二醇标准工作溶液和100μL内标标准工作溶液于样品反应瓶中,氮气吹干,以下按6. 5.1的步骤操作。
6.6 测定
6.6. 1 色谱条件
色谱柱:DB-5MS石英毛细管柱,固定相(5%苯基)-甲基聚硅氧烷,25 mX0. 32 mmX0. 52 μm;或与之相当的色谱柱。
载气:高纯氮气,纯度≥99. 999%,流速1.0mL/mino
进样口温度:250°C。
进样方式及进样量:不分流进样,1 μL
升温程序:初始柱温120°C ,保持2 min,然后以15°C/min,升至250°C,再以5°C/min升至300°C,保持 5 min。
6.6.2 质谱条件
离子源:EI源,电离能量70 eV
离子源温度:230°C
四极杆温度:150°C
接口温度:280°C
溶剂延迟:3 min
扫描质量范围:40 amu〜500 amu
选择离子监测(SIM): β-雌二醇衍生物(m /z) :416、326、285、232 ;β-雌二醇-D2衍生物(m /z) : 418、 328、287、234。
6.6.3 气相色谱-质谱分析
6.6.3.1 定性方法
样品峰与标准的保留时间之差不多于0. 10 min,并且在扣除背景后的样品质谱图中,所选择的特征 离子均出现,并且样品峰的各选择离子相对强度与标准相应选择离子相对强度相一致时(参见附录图 A. 1、A. 2),可以判断检出β-雌二醇。在6. 6. 1和6. 6.2规定的条件下,β-雌二醇和内标β-雌二醇-D2衍生物的特征离子、特征离子相对强度和允许相对偏差应符合表1要求。
6. 6. 3.2 定量方法
以β-雌二醇衍生物定量离子(m/z 416)与β-雌二醇-D2 衍生物定量离子(m/z 418)质量色谱图(见附 录图A. 3)的峰面积比单点或多点校准定量。当单点校准定量时根据样品溶液中β-雌二醇含量情况,选择峰面积相近的标准工作溶液进行定量,同时标准工作溶液和样品液中β-雌二醇响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
文章来源:《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》
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