7 测定步骤

7.1 提取

取试料5g（准确至±20mg），于50mL离心管中加碳酸钠溶液3mL、乙酸乙酯20mL，涡旋混匀，超声提取10min，4000r/min离心10min，取上清液至100mL梨形瓶中。残渣用乙酸乙酯10mL重复提取一次，合并上清液，于40°C旋转蒸发至干，用50%环己烷乙酸乙酯溶液5mL溶解残留物，备用。

7.2 净化

7.2.1 凝胶净化

将备用液转至凝胶净化柱上，用50%环己烷乙酸乙酯溶液110mL淋洗，根据凝胶净化洗脱曲线确定收集淋洗液的体积，40°C旋转蒸干，残渣用甲醇1mL溶解，加水9mL稀释，备用。

凝胶净化柱洗脱曲线的绘制：将5mL混合标准溶液上柱，用50%环己烷乙酸乙酯溶液淋洗，收集淋洗液，每10mL收集一管，于40°C水浴中氮吹至干。按7.3的方法衍生，气相色谱-质谱法测定，根据淋洗体积与回收率的关系确定需要收集的淋洗液体积。

7.2.2 固相萃取净化

固相萃取柱依次用甲醇5mL、水5mL活化，取备用液过柱，控制流速不超过2mL/min，用50%甲醇水溶液10mL淋洗，抽干，用甲醇10mL洗脱，控制流速不超过2mL/min。收集洗脱液于10mL具塞玻璃离心管中，于40°C水浴中氮气吹干。

7.3 衍生

于上述具塞玻璃离心管中加入七氟丁酸酎30/μL、丙酮70/μL，盖紧盖，涡旋混合30s，于30°C恒温箱中衍生30min，氮气吹干，精密加入正己烷0.5mL，涡旋混合10s，溶解残余物，供GC-MS分析。

7.4标准曲线的制备

取混合标准工作溶液50μL、100μL，200μL、500μL、1000μL于1.5mL样品反应瓶中，40°C水浴中氮吹至干，按7.3方法衍生，制成辛基酚、己烯雌酚浓度均为5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L的梯度系列，壬基酚、双酚A浓度均为3μg/L、6μg/L、15μg/L、30μg/L、60μg/L的梯度系列，雌酮、17α -乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇浓度均为10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，200μg/L的梯度系列。分别取1μL进样，以定量离子峰面积为纵坐标、以浓度为横坐标，绘制标准曲线。

7.5 测定

7.5.1 色谱参考条件

a）色谱柱：HP-5ms石英毛细管柱（30mX0.25mmX0.25μm），或相当者；

b）载气：高纯氦气，纯度≥99.999%，流速1.0mL/min；

c）进样方式：无分流进样；

d）进样量：1μL；

e）进样口温度：250°C；

f）柱温：初始柱温120°C，保持2min，以15°C/min升至250°C，再以5°C/min升至300°C，保持5min。

7.5.2 质谱参考条件

a）离子源：EI源；

b）离子源温度：230°C；

c）四极杆温度：150°C；

d）接口温度：280°C；

e）溶剂延迟：7min；

f）选择离子监测（SIM）：辛基酚、壬基酚、双酚A、己烯雌酚、雌酮、17α-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇衍生物的监测离子见表1。

7.5.3 测定法

7.5.3.1 定性测定

在同样测试条件下，试样液中待测物的保留时间与标准工作液中待测物的保留时间偏差在±0.10min以内，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的特征离子均应出现，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表2要求。

7.5.3.2 定量测定

按7.5.1和7.5.2设定仪器条件，以标准工作溶液浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，作单点或多点校准，按外标法计算试样中药物的残留量，定量离子见表1。标准溶液衍生物的特征离子质量色谱图参见附录B。

7.6 空白试验

除不加试料外，均按上述测定步骤进行。

文章来源：《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》

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