［实验器材]

1．仪器

倒置显微镜，CO2培养箱，普通冰箱，超净工作台，低速冷冻离心机，显微数码摄影系统，水浴锅。

2．材料与试剂

(1）非无菌材料酒精棉球，离心管架，血细胞计数板，擦镜纸，记号笔，废液缸，甲醇，冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液，30W紫外灯，水浴，饭盒。

(2)无菌材料和试剂辅料镊,6孔细胞培养板，培养瓶，15ml离心管，长丝滴管，l0ml刻度移液管，灭菌塑料吸嘴，10％BS培养液，添加有0.02%EDTA的0．25％胰蛋白酶消化液，无菌Hank's液，1.0mg/mlBrdU溶液，lmol/LHCl溶液。

(3)细胞材料悬浮细胞培养物，贴壁细胞培养物。

[操作步骤]

1．取对数期生长的单细胞悬液，以一定密度接种在培养瓶或培养孔中。

2．当培养细胞进人对数生长期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。

3．培养44-54h后，加入秋水仙素，终浓度为0.lμg/ml。

4．继续培养4-6h后，常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

5．常规染色体制片。

6．有细胞一面向下，将染色体玻片放在一饭盒中的玻璃支架上，加入2×SSC液以不超过标本表面为宜，然后在标本上覆盖一张擦镜纸，使纸的两边浸入2×SSC液中，以保持标本的湿润。

7．将饭盒放在56℃水浴锅中，湿育，上面用30W的紫外灯管6-10cm垂直照射30min。

8．弃去2×SSC液和擦镜纸，立即用4℃左右的流水冲洗。

9.Giemsa液染色5.10min，流水冲洗，干燥后镜检。

10．镜检100个细胞的分裂相，统计M1、M2、M3、M4细胞期（对应前期、中期、后期和末期这4个细胞分裂时期）分裂指数。

11．根据下式计算细胞周期

细胞周期（Tc)=48/[(M1+2M2+3M3+4M4)/100](h)

[注意事项]

1．秋水仙素的加入时机会因细胞的类型、生长速度有所差异。

2．加入BrdU后应避光培养。