［实验器材]

1．仪器

倒置显微镜，CO2培养箱，普通冰箱，超净工作台，低速冷冻离心机，显微数码摄影系统，微量移液器。

2．材料与试剂

(1）非无菌材料酒精棉球，离心管架，血细胞计数板，记号笔，琼脂粉。

(2)无菌材料和试剂辅料镊,24孔细胞培养板，15ml离心管，长丝滴管，l0ml刻度移液管，灭菌塑料吸嘴，10%BS培养液，500琼脂溶液，添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液，0.4％台盼蓝溶液，lmol/LHCl溶液。

(3)细胞材料悬浮细胞培养物，贴壁细胞培养物。

[操作步骤]

1．制备细胞悬液

取对数期生长贴壁细胞经消化、洗涤后用培养液根据实验要求稀释调整细胞密度，待用。

2，制备底层琼脂

用三蒸水配制5％琼脂溶液，高压灭菌后待温度降至50℃左右，加入预温的9倍体积含血清培养液稀释，混匀后迅速加入24孔培养板中0.8m1，室温凝固琼脂。

3．制备上层琼脂

取0.6ml保温于50℃的5％的琼脂与9.6ml单细胞悬液迅速混匀后立即加入到铺有底层琼脂的24孔培养板中，每孔0.8ml，室温凝固琼脂。

4．将培养板置细胞培养箱中培养7-14天。

5．倒置显微镜下计数集落数目，按下面公式计算结果。

集落数＝n个孔的细胞集落数总和令孔数（n)。

集落形成率＝（集落数令接种细胞总数）×100%。

[注意事项]

1．制备琼脂凝胶时尽量避免气泡和局部结块的产生。

2．琼脂与完全培养液混合温度不要超过50℃，与细胞悬液混合时的温度不要超过40℃，以免降解培养液的营养成分和损伤细胞。