[实验器材]

1．仪器

CO2培养箱、数码倒置显微镜、超净工作台、普通冰箱、空调、风淋门、洁净间、微量移液器（50-200μl)，微量移液器（1000-5000μ1)。

2．试剂与材料

血细胞计数板、血细胞计数板专用盖玻片、100oBS-基础培养基（l00ml/瓶分装）、台盼蓝染液、对数生长期的肿瘤细胞（悬浮生长型）、无菌15ml外旋盖离心管、无菌24孔细胞培养板、无菌长丝滴管、灭菌塑料吸嘴、lmol/LHCl溶液、擦镜纸、洗耳球、酒精棉球、医用酒精喷壶、酒精灯等。

［操作步骤]

1．实验准备

(1)超净工作台除尘与消毒灭菌

(2)24孔板写标识

在培养板的盖板短的方边上方靠边位置，用记号笔书写标识。标识内容包括4部分，即“培养目的”“细胞株编号”、“培养的日期”和“操作者”，每部分之间有足够间隔或使用间隔符。

①“细胞株编号”用英文和数字描述，如NSl、SP2/0、S8315、A375、A431、Hela229。

②“培养的日期”使用月日格式的4位数字，如0319、1120。

③“操作者”一般使用姓名的缩写英文。但在实际教学时，人数众多，建议以学生的学号后3位数字和姓氏表示。

2．铺放单细胞悬液

需要在24孔板上的Al-D3孔（或A4-D6孔）铺放密度相同、体积相同的12孔，每孔铺放均匀的单细胞悬液1.5m1。

将预先收集的对数期细胞用新鲜培养液悬浮于15ml离心管，混匀使成单细胞悬液。用微量移液器（按1500μl／孔）或用移液管（按1.5m1/孔）铺放到24孔板上的指定的12个孔内。

3．第1天计数

由于未进行培养，第1次计数对应的培养时间记为0h。

(1)计数板准备先用酒精棉球分别擦拭血细胞计数板的2个计数窗及其专用盖玻片，再用干净绒布或纱布擦拭干血细胞计数板的2个计数窗及其专用盖玻片的残余酒精和水分。小心装载盖玻片使悬空放置到计数板窗口上。

(2)镜检在倒置显微镜下镜检12个培养孔，挑选奇异孔（指细胞密度过高或过低的孔）作“×”标记，以示不作计数使用。从剩余培养孔中随机挑选1孔，在孔盖上方标注“1"。

(3)计数孔单细胞悬液制备使用长丝滴管无菌操作混匀标注“1"的孔内细胞，使成单细胞悬液。

也可用50-200μl微量移液器无菌操作混匀，但比较麻烦。即需注意，微量移液器应套取200μ1无菌吸嘴，调节刻度为150μl。吸取150μ1细胞悬液于2mlEppendorf管内。

(4）染色吸取150μl0.5％台盼蓝染色液于上述Eppendorf管内，使混匀。

此步骤不要求无菌操作。

(5）装载单细胞悬液至计数板从Eppendorf管内取单细胞悬液50μl，装载到计数板的2个计数窗内。分别快速点加至计数板的2个窗口的斜台上，让细胞悬液刚好布满窗口即可。

如有细胞悬液流入计数窗周边的小槽内，则需重新准备计数板再取样装载，否则计数结果偏低。

此步骤亦不要求无菌操作。

以上（3)-（5)的操作要求连贯性好，保证所取的细胞悬液有代表性，否则易产生计数偏差。

(6)镜检读数在倒置显微镜下，使用100×视场，读取所载细胞悬液的活细胞密度。活细胞即，求算每个计数窗中1、2、4、5这4个“大格”的平均细胞数N1和N2，记录值＝(N1十N2)/2。由于染色后计数，细胞密度稀释了1倍，那么细胞密度（N)=2×记录值×104/ml。

如读数值不符合计数原则，需重复（(1）-（6)步骤。

(7)血细胞计数板用后复原使用后，及时用酒精棉球擦拭血细胞计数板及其专用盖玻片，复原放置。

4．培养

将24孔板送入CO2培养箱培养。

5．第2次以后的计数操作

(1)计数时间间隔每隔12h左右或24h左右进行一次活细胞的密度镜检计数。

(2)培养孔选择及其标注从CO2培养箱取出24孔板，挑选准备用于计数的培养孔并标注。如第2次、第3次选择的计数用培养孔，应在孔盖上标注“2n”、“3n”字样，其他情形类推。

相邻2次计数所用的孔应注意随机挑选，不得顺序取用。

(3)超净工作台除尘与消毒灭菌。

(4）计数操作方法同前述步骤3之（1)-（7)，即：

计数板准备→计数孔单细胞悬液制备→染色装载单细胞悬液至计数板→镜检读数→血细胞计数板用后复原。

(5)培养将24孔板送入CO2培养箱培养。

6．计数操作结束

直至活细胞密度不可计数时，停止计数操作。

7．绘制细胞生长曲线

统计每次计数孔的累计培养时间（单位h)和细胞密度，以细胞密度的对数值为纵坐标，培养时间为横坐标，描绘出折线图。正常情况下，活细胞的生长曲线应体现典型的4个生长时期，需在所绘曲线上标注说明。

［结果观察与记录］

1．记录每次计数所对应的培养孔编号、累计培养时间（h)、每次计数时培养孔内的细胞密度（个／ml)。

2．统计先后观察到的各培养孔细胞密度和累计培养时间，绘制活细胞的生长曲线。

［注意事项〕

1．接种细胞的密度取决于细胞的生长特性和培养时间的长短。通常所接种的细胞密度不宜太大，否则细胞很快就会进入稳定期，所得曲线不能准确反映细胞的生长情况。

2．如果细胞密度未到达生长极限，尚有足够的生长空间，可以在培养3-5d后为准备计数用的细胞培养物统一进行换液。换液时掌握定量换液，即移除的体积数和添加的体积数等同。

3．生长曲线作为一种常规方法的缺陷是数值不够精确，对细胞生长规律的准确评价需结合其他方法进行，利用MTT法测定生长曲线就是一种较好的选择。