一、实训目标

1．了解试液（APC片剂）的制备方法；

2．了解高效液相色谱法（HPLC)中流动相的组成和pH对组分的滞留和分离的影响；

3．掌握高效液相色谱仪的操作要点及外标法。

二、实训原理

APC（复方阿司匹林）是应用广泛的解热镇痛药，其有效成分为乙酰水杨酸（阿司匹林）、非那西汀和咖啡因。乙酰水杨酸易水解，在生产及贮藏期间容易引入水解产物（水杨酸），APC的分析往往也包括水杨酸的测定。采用HPLC可将上述成分分离，HPLC中流动相的组成和pH对组分的滞留和分离影响很大，实验证明，以2600（体积分数）的甲醇水溶液（pH=2.3)为流动相，上述组分可在ODS柱上达到满意的分离，且分析时间较短。上述组分在紫外区都有吸收，可将检测器波长置于λ=285nm处进行测定。

在相同的操作条件下，分别将等量的试液和含待测组分的标准溶液进行色谱分析，比较试液和标准溶液中待测组分的峰值，即可求出试液中待测组分的含量（此即为外标法）：

ρi=ρs(Ai/As)

式中ρi——试液中组分i的质量浓度；

ρs——标准溶液中组分i的质量浓度；

Ai——试液中组分i的峰值；

As——标准溶液中组分i的峰值。

三、实训仪器与试剂

1．仪器

Agilent1100高效液相色谱仪；色谱柱（4.6mm×100mm);ODS(5μm)；紫外可见检测器定量管（(20μL)；微量注射器（50μL)；精密酸度计；超声波振荡器；研钵；0.45μm滤膜（水系）减压抽滤系统；微量离心过滤管；烧杯；量筒；容量瓶及移液管等。

2．试剂

甲醇(A.R.);KH₂PO₄(A.R.);H₃PO₄(A.R.);APC片剂；阿司匹林；水杨酸；咖啡因；非那西汀的纯品或标准试剂；去离子蒸馏水。

四、实训步骤

1．流动相的制备

准确称取KH2PO41.3609g置于1000mL烧杯中，加700mL水搅拌、溶解，以500mL量筒量取甲醇260mL，倾入1000mL烧杯中，摇匀。滴加10%H3PO4调节上述溶液至pH=2.3（精密酸度计测定）后，转移至1000mL容量瓶中，再滴加水至容量瓶刻度，摇匀。

流动相应以0.45μm滤膜减压过滤，超声波脱气30min。

2．试液和标准溶液的制备

(1)试液的制备取1片APC，于研钵中研细后置于50mL烧杯中，加入甲醇l0mL,超声波振荡提取20min。过滤，滤液转移至25mL容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，即制成贮备液。使用前用水将贮备液稀释4倍即成试液。

(2）标准溶液的配制精确称量并用甲醇配制阿司匹林（0.5mg/mL)、水杨酸(0.5mg/mL)、咖啡因（0.lmg/mL）和非那西汀（0.5mg/mL）三种标准贮备液，冰箱中贮存，使用前用水将贮备液稀释4倍即制成标准溶液。

试液和标准溶液进柱前均需通过0.45μm滤膜过滤。

3．色谱条件及操作

开机，将流速、波长等设置好，待基线平稳后即可进样。

将进样阀置于取样位置，用50μL微量注射器取约35μL试液注入，充满20μL定量管。旋转进样阀至进样位置，计时，得试液色谱图。

4．实验结果和讨论

比较试液和标准溶液谱图中相同组分的峰面积（或峰高），按外标法计算公式可求出试液中某成分的含量（mg/mL)由试液的配制过程可求出每片APC中该成分的含量（mg／片）。

以上述值为标准值计算某成分测定的相对误差，并讨论。

五、注意事项

(1）为保证试样的代表性，可任取APC10片。研细、混匀、干燥、称量，再从中称取1/1。质量的APC粉末进行实验。

(2)使用甲醇时宜在通风橱内操作。

(3)流动相、试液均应以0.45μm滤膜减压过滤，以免堵塞进样阀、毛细管和色谱柱。

(4)阿司匹林易水解，水杨酸易氧化，用甲醇配制的贮备液在冰箱中可贮存一周。

(5)按上述步骤可以确定试液色谱图中每个峰的归属并测定其含量，若配制混合标准溶液，则可一次测定三种成分的含量。