蛋白质印迹（Western blotting）是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法，又称免疫印迹（immunoblotting )。1979年，Towbin等将分析DNA的Southern blotting技术扩展到蛋白质的研究领域，并且和特异、灵敏的免疫分析技术相结合，称之为“Western blotting"（蛋白质印迹）。免疫印迹可分为两个步骤：将蛋白质由凝胶转移至固相基质上；特异性抗体检测。

实验原理

蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将凝胶上的蛋白质以电转印的方式，转印至固相支持物（如硝酸纤维素膜，NC膜）上，再用特异抗体作为探针对靶蛋白进行检

测的方法。由于该方法结合了PAGE的高分辨率和固相免疫反应的高特异性等多种优点，可检测到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。

仪器和材料

电转移装置（电源）；摇床；暗匣；转印夹；浅盘（30cm×15cm×3cm)；玻璃棒；杂交袋或杂交盒；胶片；保鲜膜；滤纸；0. 22μm孔径的硝酸纤维素膜。

试剂

(1) Running Buffer (Tris-甘氨酸电泳缓冲液，1×2500ml) ;

25 mmol/L Tris 7. 55g

250mmol/L甘氨酸 47. 0g

10%SDS 25m1

(2) Transfer Buffer ( Tris-甘氨酸电转膜缓冲液，1× 2500m1，pH＝8.3）：

48 mmol/L Tris 14. 50g

39mmol/L 甘氨酸 7. 25g

10% SDS 9. 25ml

20％ 甲醇 500m1

(3) TTBS缓冲液（pH 7.5，2 ×2500ml)：

20 mmol/L Tris 12. l l g

0. 5 M NaCl 146. 1 g

0.05%Tween 20 2. 5 ml

(4) Stripping Buffer（pH2. 0，1000m1)：

甘氨酸 1. 8768

SDS 10. 0g

(5) 10％牛奶封闭液：

称取10. 0g脱脂奶粉，溶于80m1 TTBS（pH7. 5 )中，搅拌完全溶解，后加入TTBS定容至100m1，再加入10μl Thimerosal混匀。

(6) 10 ×丽春红染液

丽春红 2. 0g

三氯乙酸30.0g

磺基水杨酸 30. 0g

蒸馏水 100m1

(7）第一抗体（以β-actin为例）。

(8) 酶联第二抗体（如：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗）。

操作步骤

蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合蛋白，又不影响蛋白质抗原活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性等特点。常用的支持物有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF膜。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式。

(1) 半干式电转印

1) 将NC膜和滤纸切成与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5-l0min。

2) Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，戴手套取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去。将玻璃板放入转移缓冲液中，掀起凝胶的一角缓慢从玻璃板上取下凝胶。

3）按照以下顺序放置：滤纸，凝胶和NC膜到半干槽中。

4）每层之间的气泡要全部去除。可以用玻璃棒轻轻在上一层滚动去除气泡。然后，用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点，以防电流直接从没有凝胶处通过造成短路，盖好加上阳极电极板。

(2) 湿式电转印

1) Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取出凝胶的方法同半干式电转印。

2）打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海绵垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，一般用3层滤纸就可以了。滤纸与NC膜，凝胶大小相同，将NC膜平放在阳极侧滤纸上，之后将凝胶平放在NC膜上再盖上3层滤纸，用玻璃棒轻拼滤纸以去除气泡，夹好电转印夹。

3) 电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，连接好电极，接通电流，一般用400mA转印3-4h。转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。（转膜液事先预冷至4℃）。

印迹膜上总蛋白染色

在确定印迹中是否存在总蛋白之前，通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白的组成情况，并可确定蛋白质分子质量标记物的位置和转印是否成功。同时，该方法也清楚地显示出转印蛋白质的复杂性。但条件摸索成熟后，不建议用此法。

丽春红S印迹膜染色法：

丽春红S适用于酸性水溶液，但是染色不持久，在后续的处理中红色染料易被洗去。由于与蛋白质的结合是可逆性的，该染色方法适用于所有显示抗原的技术，而不影响后续的免疫检测。丽春红S带负电荷，可与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色条带。

操作步骤：

1) 转印结束后，取出印迹膜至于丽春红S应用液中，并在室温下搅动5-l0min。

2) 将膜放入TTBS洗数次，每次1-2min，并且更换TTBS。

3）根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记。

至此膜可以用于封闭和加入抗体。

免疫检测

(1) 膜封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质，常用的有20% BSA、10％马血清，以及10％脱脂奶粉等。至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A (SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭。此外，应尽可能使非特异着色背景浅，封闭液以20% BSA效果最好，其次是10％脱脂奶粉。

封闭过程：

1) 洗转印膜：室温TTBS漂洗3次，每次l0min，尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。

2）取出漂洗的转印膜，放入10％脱脂奶粉的封闭液内，摇床振动，室温封闭lh左右。回收封闭液，以备重复使用。

3）用蒸馏水冲洗膜数遍后，再用1×TTBS ( pH7. 5 )洗液，室温漂洗3次，每次l0min。

(2) 抗体杂交抗体杂交主要采用间接法。即先加入未标记的特异性抗体（一抗）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（二抗）进行杂交检测，标记二抗的物质有放射性核素、酶，以及生物素等。

杂交过程：

1) β-actin兔抗鼠单克隆抗体按1：1000比例稀释于20m1TTBS液中，并加入0. 01 % Thimerosal。

2）封闭后的NC膜放入杂交袋或杂交盒中，加入抗体稀释液稀释的β-actin一抗[浓度为1：1000 (V/V )］，4℃孵育过夜或室温摇动孵育3-4h。然后，回收抗体，4℃下，保存，以备重复应用。

3) 蒸馏水冲洗膜数遍后，用TTBS液洗膜3次，每次l0min。

4) 辣根过氧化物酶(HRP）标记的抗兔IgG 1 : 5000稀释于20mlTI'BS液中，在杂交盒内室温孵育1h。

5）弃二抗溶液，蒸馏水冲洗膜数遍，再次用TTBS液洗膜，共3次，每次10min。

(3）信号检测根据标记二抗的标记物不同，其杂交结果的检测方法也不同，较常用的检测系统有HRP标记二抗的增强化学发光(ECL）和DAB检测系统。
辣根过氧化物酶-DAB法：

1) DAB显色液的配制：按照lml H2O加显色剂A、B、C各1滴，混匀。

2) 显色：将适量DAB显色液平铺在二抗杂交后的印迹膜上，室温放置观察，可出现明显的棕褐色蛋白显色带。

3）终止：用Tris·HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应。

辣根过氧化物酶-ECL法：

增强化学发光（ECL）检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间产物，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶片感光原理，将结果记录下来：

1）依据SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate试剂盒的说明，取发光剂和增强剂各1 ml，按1：1比例混合，倒入盛有 NC膜的杂交盒内，用手轻轻摇动杂交盒，使发光剂及氧化剂混合均匀并与膜表面充分接触。

2) 5min后，取出膜，用保鲜膜包裹，排净气泡，将NC膜贴在暗盒上，进入暗室曝光。

3）取一张X线胶片，将感光面对准NC膜，放在膜的正上方，合上暗盒，开始计时，曝光5min后取出X线胶片，立即投入显影液中。显影5min，用水漂洗X线胶片数次，然后把X线胶片移入定影液中定影10-20min。曝光完毕即可得到有清晰β-actin条带的X线片，流水冲洗数分钟，悬挂晾干。不同条件下（如检测信号强弱不同），曝光时间不同，可短至几秒，也可以长到数小时。实验结果应用Gel Doc凝胶成像系统中的Quantity One图像分析软件进行半定量分析。

以低氧预适应对小鼠海马组织内丝裂原和应激激活蛋白激酶(MSK )磷酸化水平影响为例，图15.1和15.2分别为磷酸化MSK(p-MSK）和内参照β-actin的典型免疫印迹结果；图15.3为p-MSK的定量分析结果。

5注意事项

(1) 湿式电转印开始前，要先打开循环冷凝系统，蛋白转印条件为：4℃、400mA。

(2）首次转移时，可同时转两块胶，一块染色，用以检查转移效率，另一块进行免疫印迹。

(3）检测的目的蛋白分子量较小时，要用小孔径的NC膜，如：0. 22 μm 。

(4）免疫印迹杂交的敏感度与检测系统有关，因此，凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低。如果过低，样品应该重新纯化和浓缩后再使用。建议做一次梯度稀释，选择最佳上样量。

(5）为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接进行转印。

(6）取出凝胶后，应注意分清上下方向，可用刀片切去凝胶的一角作为标记（如左上角）。转膜时也应用同样的方法，对NC膜做标记（如左上角）以分清正反面和上下关系。

(7）转膜时，应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极，即凝胶对应负极，NC膜对应正极。

(8）曝光后，背景过高可能有以下原因：抗体杂交后洗膜不充分、抗体浓度过高或封闭不充分等。

(9）条带过浅的可能原因：抗体浓度不够、抗体效价降低、时间过短或蛋白含量低等。

(10）当检测的两种蛋白的分子量比较接近时，可以用Strippingbuffer漂洗去除已结合的一抗和二抗，这样一张印迹膜可以多次使用。