原生质体培养方法主要有固体培养法、液体培养法和固一液结合培养法。另外对于低细胞密度的原生质体培养，还可以采用饲养层培养法、共培养法和微滴培养法等。而在原生质体应用于生物转化中时，经常采用固定化原生质体培养技术进行固定培养。

一、固体平板培养法

原生质体的培养方法和对培养条件的要求常与单细胞培养相似。故原生质体的培养也可按照单细胞的平板方法进行。首先把原生质体悬浮在液体培养基中(密度为104个／mL左右)，与高压灭菌后冷却至42～45℃的培养基(2倍固化剂浓度)用大口刻度吸管迅速等量混匀，并迅速转移到培养皿中，旋转培养皿，瞬间便凝固，用石蜡膜带密封，暗培养。培养基层不宜过厚，一般2～3mm。培养5～7d原生质体开始分裂，3周左右观察细胞植板率。待形成大细胞团后，转移到去除渗透压调节剂的新鲜固体培养基中继代培养。

近年来发现，用琼脂糖代替琼脂粉可以提高植板率。特别是对于那些在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体，使用琼脂糖可能会取得比较好的效果。低熔点琼脂糖可在30℃左右融化，与原生质体混合不影响原生质体的活力。该方法的优点：原生质体分布均匀，有利于分裂；容易获得单细胞株系；可定位观察单个原生质体的生长发育情况。缺点：原生质体易受热伤害；易破碎；原生质体始终处在高渗透压胁迫下，生长发育缓慢，植板率低。

二、液体浅层培养法

尽管固体培养有上述优点，但很多研究者还是喜欢使用液体培养基，这是因为，当使用液体培养基的时候，经过几天培养之后，可用有效的方法把培养基中的渗透压降低；另外，如果原生质体群体中的蜕变组分产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以随时更换培养基；再有，经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或把目标细胞分离出来。

本方法是用液体培养基进行原生质体培养。把纯化后的原生质体用液体培养基调整好密度，用吸管转移到培养皿中，石蜡膜带密封，在培养室暗培养。培养基层厚2～3mm。培养5～10d细胞开始分裂，此时开始降低培养基中的渗透压。每隔一周用刻度吸管吸取不含渗透压调节剂的新鲜液体培养基来置换原液体培养基。当形成大细胞团后，转移平铺在去除渗透压调节剂的固体培养基上增殖培养。

本方法的优点：操作简单，对原生质体伤害小；可微量培养；能及时降低渗透压并补加新鲜培养基，细胞植板率高。缺点：原生质体沉淀，分布不均匀；形成的细胞团聚集在一起，难以选出单细胞无性系。

三、固-液结合培养法

该方法是原生质体培养所有方法中效果最佳的方法。先把原生质体采用固体平板培养法包埋在培养皿底层(平铺或数滴)，上面再加入相同成分的液体培养基(或添加0．1％～0．3％的活性炭)，用石蜡膜带密封后进行暗培养。当细胞开始分裂后，用新鲜液体培养基更换原液体培养基(至少每周定期更换一次)，这样能够稀释和除去培养物所产生的有害物质。在更换用的液体培养基中添加0．1％～0．3%的活性炭，效果尤佳。当形成大细胞团后，转移平铺在去除渗透压调节剂的固体培养基上培养。

还有一种称为双层培养的方法，即固体和液体培养基结合的双层培养，是在培养皿中先铺一薄层琼脂或琼脂糖等凝固的固体培养基，然后将原生质体悬浮液植板于固体培养基上。固体培养基中的营养成分可以慢慢地向液体中释放，以补充培养物对营养的消耗，同时吸收培养物产生的一些有害物质，有利于培养物的生长。此外，固体培养基中添加活性炭或可溶的PVP，能更有效地吸附培养物所产生的酚类等有害物质，促进原生质体培养。

本方法的优点：原生质体分布均匀，有利于分裂；容易获得单细胞株系；因能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。缺点：原生质体易受热伤害；原生质体易破碎。

四、饲养层培养法

在动物干细胞培养中，最常用饲养层细胞进行培养。所谓饲养层细胞就是指一些特定细胞(如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞)，经有丝分裂阻断剂(常用丝裂霉素)处理后所得的单层细胞。

在植物细胞培养中，也可以借助动物细胞培养的方法，利用经X射线处理的细胞作为培养的条件因子，包埋在培养基中作为饲养层细胞，促进细胞分裂提高植板率，该技术叫饲养层培养。这种方法最初是Raveh等(1973)建立的一种在低密度下培养原生质体的方法。在一般情况下，当植板率低于104个细胞／mL时，烟草原生质体不能分裂，但是通过饲养层培养法，这些细胞可在低至10～100个原生质体／mL的密度下进行培养。这对于获得单细胞无性系、避免产生嵌合体来说，无疑是种很有效的培养方法。

1.饲养层细胞及处理

使用X射线照射的植物原生质体可以作为饲养层细胞，采用最适剂量的X射线照射原生质体，达到完全抑制原生质体分裂的目的。这一剂量能抑制细胞分裂，但并不破坏细胞的代谢活性。然后用液体培养基多次洗涤处理过的细胞，除去有毒的游离基团。对于分裂慢或不分裂的具有代谢活性的原生质体，不进行照射也可直接作为饲养层细胞。

可以选择与靶细胞的颜色不同的细胞或愈伤组织作为饲养层纽胞，便于观察和区别。饲养层细胞与靶细胞可以是同种植物，也可以是比较远缘的植物，但二者必须都能在同一培养基上生长。例如烟草原生质体饲养柑橘原生质体，胡萝卜细胞培养物饲养烟草原生质体和细胞等。

2．包埋培养

将饲养层细胞和靶细胞进行包埋可以采用2种方法，即混合培养和分层培养。混合培养是将饲养细胞(例如经射线处理的原生质体)和培养细胞(或称靶细胞)均匀包埋在琼脂培养基中，用常规平板培养法进行培养。分层培养饲养细胞与琼脂培养基混合平铺在培养皿底层，将靶细胞平铺培养在上层，进行常规培养。

该方法与看护培养具有一定的相似之处，都是利用细胞分裂过程中的活性物质作为条件因子，促进靶细胞的分裂。

五、微滴法

使用一种构造特别的培养皿，培养单个原生质体及由这些原生质体再生细胞。这种培养皿具有两室，小的外室和大的内室。内室中有很多编码的小穴，每个小穴能装0．25～0．5μL培养基。把原生质体悬浮液的微滴加入到小穴中，在外室内注入无菌蒸馏水以保持培养皿内的湿度。把培养皿盖上盖子以后，用封口膜封严。对于单个原生质体分裂来说，微滴的大小是关键因素。每0．25～0．5μL小滴内含有一个原生质体，在细胞数对培养基容积的比率上相当于细胞密度为(2～4)×103细胞／mL。增加微滴的大小将会降低有效植板密度。有报道称，当微滴为2μL时，微滴中的单个细胞就不能分裂。在粉蓝烟草+大豆和拟南芥+油菜杂种细胞培养中，应用微滴法已取得了成功。

六、固定化原生质体培养技术

固定化原生质体是指固定在载体上，在一定的空间范围进行新陈代谢的原生质体。固定化原生质体培养是将固定化原生质体在一定条件下进行培养，获得所需的代谢产物的过程。

固定化植物原生质体一方面保持了植物细胞原有的新陈代谢能力，可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物；另一方面，由于去除了细胞壁这一扩散障碍，细胞膜的透过性增强，有利于胞内产物分泌到细胞膜外。加上载体的保护作用，固定化原生质体具有较好的操作稳定性和保存稳定性。

通过固定化原生质体培养，可以使较多的胞内物质分泌到细胞外，可以不经过细胞破碎，直接从培养液中分离得到所需的代谢产物。本法为胞内产物的生产开辟了新途径。固定化植物原生质体还可以用于生物转化，经过原生质体产生的酶或酶系的作用，将底物转化为人们所需的产物。

1．原生质体固定化方法

原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液。然后采用包埋法制成固定化原生质体。原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等。现举例说明如下：

(1)琼脂一多孔醋酸纤维素固定化法用生理盐水配制3％左右的琼脂，加热溶解灭菌后，
冷却至50℃左右，与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合均匀。将混合液用滴管滴到一定形状的多孔醋酸纤维素上，置于冰箱或冰盒中冷却凝固，制成固定化原生质体。

(2)海藻酸钙凝胶固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制成一定含量的(3％～6％)海藻酸钠溶液，与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合均匀，将此混悬液用滴管或注射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中，浸泡1～2h，制成直径为1～4mm的球状固定化原生质体。

(3)角叉菜胶固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制成一定含量(3％～8％)的角叉菜胶，加热溶解，灭菌后，冷却至50℃左右，与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合均匀，将混悬液滴到一定浓度的预冷的氯化钾溶液中，制成球状固定化原生质体。

(4)光交联树脂固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制30％～60％的光交联树脂预聚体，加热溶解灭菌后，冷却至50℃左右，加入l%的光敏剂，与等体积的原生质体悬浮液混合均匀，摊成薄层，经紫外光照射2～3min，聚合后切成一定形状的小块，制成片状固定化原生质体。

此外也可选用其他适宜的凝胶或中空纤维为载体，制备固定化原生质体。

2．固定化原生质体的特点

固定化原生质体主要用于生产各种胞内产物和进行生物转化。具有下列显著特点：

(1)提高产率和转化率。固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，在用于胞内产物的生产时，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率；在用于生物转化时，有利于外源底物进入细胞膜内，也有利于反应产物扩散到细胞膜外，从而提高转化率。

(2)稳定性较好。固定化原生质体由于有载体和渗透压稳定剂的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在培养结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。

(3)利于产物的分离。原生质体经过固定化，制备成一定形状的颗粒，易于和产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。

3．固定化原生质体的培养方法

固定化原生质体培养通常采用液体悬浮培养，即将固定化原生质体悬浮在液体培养基中，在一定条件下进行培养。液体培养基中必须含有适量的渗透压稳定剂，以免原生质体受到破坏。在固定化原生质体培养过程中，要使胞内产物不断地分泌到细胞膜外，必须尽可能防止细胞壁的再生，以保持固定化原生质体的分泌能力，为此，可以在固定化原生质体的培养过程中，添加适量的纤维素酶和果胶酶进行处理。培养所使用的反应器主要有气升式反应器、鼓泡式反应器、硫化床式反应器和膜反应器等。