一、供试材料

1．材料的种类及生理状态

(1)叶片为分离材料  叶片是使用最广泛的分离原生质体的材料。经处理可以促使一些植物的原生质体分裂，或者提高原生质体再生植株频率。预处理包括黑暗处理、低温处理和预培养。例如，甘蔗植株在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂；而龙胆试管苗叶片在4℃下处理后原生质体才能分裂。将四倍体和双单倍体马铃薯3～4周龄试管苗上完全展开的叶片用于分离原生质体，原生质体分裂率和再生率高。当表皮细胞不容易去掉时，应将叶片剪成1～2mm大小后进行酶解处理。如果在酶解剪碎叶片时结合适当的真空渗透处理，使酶液进入细胞间隙，能缩短酶解时间和提高叶肉原生质体产量。酶解前将叶片置于无酶的原生质体分离液中一段时间，使叶肉细胞发生质壁分离，以利于加入酶液后纤维素酶和果胶酶迅速消化细胞壁。

(2)愈伤组织的类型  愈伤组织也常常用于分离原生质体。在植物组织的诱导、培养和继代过程中出现了多种类型的愈伤组织，这些愈伤组织在颜色、外部形态、质地和生长状况等方面都有着明显的差别。美味猕猴桃愈伤组织大致可分为4种类型：A型愈伤组织生长快，结构较疏松，外呈瘤状突起，培养一段时间后若不继代往往出现褐化；B型愈伤组织色泽鲜艳，质地较松脆或外松内实，易培养，常呈颗粒状；C型愈伤组织质地致密坚硬，表面有突起，生长较慢；D型愈伤组织色泽暗淡，结构松散柔软，生长很慢或不生长，在培养过程中常逐渐褐化死亡。A型愈伤组织分离原生质体数量最多，但存活率较低；B型愈伤组织分离的原生质体不仅数量较多，而且存活率也高，是一种最适于分离和培养原生质体的愈伤组织；C型愈伤组织分离的植物原生质体培养及体细胞杂交原生质体数量较少，但存活率较高；D型愈伤组织分离的原生质体数量较多，但存活率低。因此，就美味猕猴桃而言，愈伤组织的继代培养和原生质体的分离中主要选B型愈伤组织。

与愈伤组织材料一样，胚性愈伤组织的状态对于原生质体的分离也存在差异。桉树胚性愈伤组织在发育过程中主要以3种状态存在：工类为未分化的胚性愈伤组织，形态为黄色松软型，可自然散开；Ⅱ类为开始分化，但是在胚发育的初级阶段，形态为黄色和红色夹杂的愈伤组织，形态较松软；Ⅲ类为红色坚硬愈伤组织，这类愈伤组织已分化出大量胚状体，质地特别硬。3类愈伤组织继代15d后，用于分离原生质体，结果发现，I类愈伤组织的原生质体的产量最高；Ⅱ类愈伤组织的原生质体产量明显下降；Ⅲ类则几乎没有游离出原生质体。因此，就桉树而言，I类胚性愈伤组织状态更适合原生质体的分离。

愈伤组织的生理状态之所以对原生质体产量有大的影响，主要在于年龄较大或分化程度较高的细胞其细胞壁厚难于去除，细胞已液泡化，即使去除细胞壁，原生质体也较易破裂。

对于一些植物尤其是禾本科植物来说，不容易分离到大量的叶肉原生质体，或者当叶肉原生质体再生细胞不能持续分裂时，悬浮培养细胞是非常好的分离原生质体的材料。与愈伤组织类似，只有生长分裂旺盛的悬浮培养细胞适合于作为分离原生质体的材料。此外，禾本科植物悬浮培养细胞的来源十分关键，用幼胚外植体诱导的胚性愈伤组织建立胚性细胞系，其原生质体再生细胞能通过体细胞胚胎发生途径再生植株。用非胚性细胞系分离的原生质体，大部分原生质体培养后只形成愈伤组织而没有形态发生的能力。

(3)悬浮细胞生长期取火炬松的胚性细胞悬浮系不同生长时期的悬浮细胞，用酶液处理，分离原生质体。结果表明，对数生长期的胚性悬浮细胞的原生质体产量和活力均最高。晚松细胞悬浮系对数生长期的悬浮细胞的原生质体产率和原生质体存活率也较高。由此表明，在以悬浮培养细胞作为原生质体分离的初始材料时，也要考虑到细胞的生长周期对分离产生的影响。

2．继代时间

继代培养时间较长的愈伤组织，分离原生质体产率低，较难分离。可能是由于细胞老化及细胞生理状态发生改变所致；也可能是细胞次生代谢物积累过多，使细胞生理活性降低。而继代培养时间短，愈伤组织因转代后恢复生长不久，形成的新细胞团较少，取材量小，同样影响原生质体的得率，因而在取材时一定要掌握好取材时间。
玉米愈伤组织继代培养16d，分离纯化得到的原生质体存活率在95％以上；而继代培养24d，分离纯化得到原生质体存活率仅为75％左右。说明玉米愈伤组织继代培养16d是分离原生质体的较好时期。继代培养不同时间的苹果愈伤组织及悬浮培养系分离原生质体的效果不同。继代10～15d的花粉愈伤组织较继代16～30d的同样材料分离得到较高产率和存活率的原生质体。

人参悬浮细胞培养7d继代一次的材料，分离得到的原生质体数量多，且容易分裂；14d继代一次的材料，分离得到的原生质体少，生理活性较低，不易分裂成细胞团。以罗田甜柿休眠芽茎尖诱导的愈伤组织为试验材料，发现继代10d的愈伤组织可以分离到较高产率和存活率的原生质体。而龙眼则以继代5d的悬浮细胞分离原生质体的效果最好。荔枝胚性细胞悬浮培养物，以继代3～4d的细胞分离的原生质体产率和存活率最高。

二、前处理

由生长在非无菌条件下的植株上取来的组织，首先必须进行表面消毒。一般来说，消毒方法为器官和组织消毒的常规方法。根据一些研究表明，对禾谷类植物叶片进行表面消毒时，效果最好效率最高的方法是把它们用苄烷铵(Zephiran)(0．1％)一酒精(10％)溶液漂洗5min。

叶片表面消毒的另一种方法是用70％酒精漂洗，然后再在超净台上使叶片表面的酒精蒸发掉。

要保证酶解能充分进行，必须使酶溶液渗入到叶片的细胞间隙中去，为达到这个目的可以采用几种不同的方法，其中应用最广泛的是撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片飘浮在酶溶液中。如果叶片下表皮撕不掉或很难撕掉则可把叶片或组织切成小块(约2mm²)，投入到酶溶液中。若与真空渗入相结合，这种方法不但十分方便，而且也非常有效。据报道，若以真空处理3～5min，使酶液渗入叶片小块，在2h内即可把禾谷类植物的叶肉原生质体分离出来。检测酶溶液是否已充分渗入的标准，是当真空处理结束后大气压恢复正常，小块叶片是否下沉。代替撕表皮的另一种有效方法是用石英砂摩擦叶的下表面。在酶处理期间进行搅拌或震动可以增加培养细胞原生质体的释放率和产量。

三、酶及酶解

不同植物种类或同一植物的不同器官以及它们的培养细胞，由于细胞壁的结构不同，分解细胞壁所需的酶也不同。例如，叶片及其培养细胞采用纤维素酶和果胶酶联合使用；根尖细胞以果胶酶为主，附加纤维素酶；花粉母细胞和四分体小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶联合；成熟花粉细胞用果胶酶和纤维素酶联合。一般来说以幼苗的叶片、下胚轴等器官为材料游离原生质体时，去壁相对容易，应选用活性较弱的酶，且酶的浓度要低，以愈伤组织悬浮培养系为材料游离原生质体时，应选用活性较强的酶。决明子原生质体游离时，果胶离析酶PecolyaseY一23是必需的。离析酶的加入有利于提高叶肉原生质体的游离，而果胶酶则很难游离出原生质体。蜗牛酶对茴香胚性细胞悬浮系原生质体的游离是必需的。
除了酶的种类外，酶液含量对原生质体分离效果也有很大影响。如酶液中的纤维素酶和离析酶对辣椒子叶原生质体的产量和活力均有重要影响。CellulaseOnozukaR一10含量为
1．5％时原生质体的产量与活力均最高，高于或低于此含量，原生质体产量与活力均有所下降。而果胶酶MacerozymeR一10对原生质体的产量、活力的影响不尽一致，酶含量由0．2％增至0．5％时，原生质体的产量大幅度提高，继续提高酶的含量，原生质体的产量明显下降，原生质体的活力则随酶含量的增加呈下降趋势。综合考虑酶含量对原生质体的产量和活力的影响，1．5％纤维素酶和0．6％果胶酶组成的酶液最适于辣椒原生质体的分离。

用酶解法制备原生质体时应根据酶解液的组成和含量选择合适的酶解时间。在同一酶解条件下，酶解时间越长，原生质体的产量愈高，但原生质体的活力下降，因此应尽量降低酶对原生质体的毒害作用，短时间酶解，获取大量有活力的原生质体。草莓花药愈伤组织原生质体游离时，在同一酶解条件下，比较了5个酶解时间(1h、5h、10h、13h、14h)，结果发现酶解13h后，大部分愈伤组织被酶解，且活力达67．35％。比较不同酶解时间对辣椒原生质体的分离效果，发现酶解时间在4～10h范围内，随酶解时间的增加，原生质体的产率显著提高，酶解10h原生质体产量可达17．65×10⁶个／g(鲜重)，继续增加酶解时间，原生质体产率明显下降，同时可以观察到酶液中原生质体碎片增多。可见，长时间的酶解可导致原生质体破坏。同时，长时间的酶解还可能对原生质体的存活率造成不利影响。酶解时间在4～8h时，原生质体存活率无明显差异，再继续增加酶解时间，则原生质体存活率显著下降。酶解时间不同，活原生质体的得率有很大差别。

一般在游离植物原生质体时，采用在摇床上振荡酶解有利于原生质体的释放。进行野大麦原生质体游离时以80r／min在摇床上酶解，随着振荡时间的延长，原生质体得率不断提高，振荡4h时得率达最高，为8×10⁶个／g，而在静止条件下酶解4h时其原生质体得率为3．4×10⁵个／g，仅为振荡酶解时的1／24，在振荡酶解2h后再静止酶解2h，其得率为7．1×10⁵个／g，为振荡酶解时的1/11。在其他的植物原生质体游离时，也发现振荡酶解有利于原生质体的释放。原因可能是低速振荡增加了酶解液与进行酶解的材料的接触，同时还增加了氧气的供应，对原生质体的释放有利。

四、渗透压稳定剂

在原生质体制备过程中，为了防止原生质体被破坏，一般要采用高渗溶液，以利于完整原生质体的释放。配制高渗溶液的溶质称为渗透压稳定剂。常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。在降解细胞壁时，渗透压稳定剂常和酶制剂混合使用。通常用渗透压稳定剂来稀释酶液。渗透压稳定剂中最常用的是甘露醇、蔗糖和山梨醇。如甘露醇常用于烟草、胡萝卜、柑橘、蚕豆等的原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等植物；山梨醇常用于油菜等植物。

渗透压稳定剂的种类和浓度应根据植物种类不同而异，如同样采用甘露醇，胡萝卜的使用浓度为0．56mol／L、柑橘为0．8mol／L、蚕豆为0．7mol／L，烟草的成熟花粉其使用含量为13％。在火炬松的胚性悬浮细胞原生质体分离的研究中，以甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖为渗透压稳定剂，用酶液(Cellulase Onozuka RS+Cellulase 0nozuka R10+Pectolyase Y一23)分离胚性悬浮细胞的原生质体，结果表明，以13％的甘露醇作为渗透压稳定剂的，原生质体的产量和原生质体的活力均最高，分别为8．2×10⁴个／mg(鲜重)和63．3％。

还有一类是利用无机盐溶液作为渗透压稳定，由CaCl₂、MgSO₄、KCl或培养基中的无机盐组成。这类渗透压稳定剂的优点是原生质体的产量比用甘露醇高。缺点是会降低细胞壁降解酶的活性，高浓度的无机盐会进入细胞内，影响培养效果。

五、质膜稳定剂

添加细胞质膜稳定剂有利于提高原生质体的产率和存活率。细胞质膜稳定剂的作用是增加完整细胞质膜的数量，防止细胞质膜被破坏，促进原生质体再生细胞壁和细胞分裂以形成细胞团。常用的细胞质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、2一N一吗啉乙磺酸(MES)、无机钙离子(CaCl2)和磷酸二氢钾等。葡聚糖硫酸钾能够抑制酶液内某些酶如RNA酶的活性，有助于质膜稳定，保护原生质体，对细胞壁的再生和细胞团的形成有促进作用。如在烟草的原生质体分离时，在酶液中加入葡聚糖硫酸钾，洗净酶液后进行培养，原生质体很快长细胞壁，而且分裂快，容易形成细胞团；而不加葡聚糖硫酸钾，原生质体经1周培养后即死亡。0．1%CaCl₂·2H₂O能为膜蛋白所束缚，提高膜的钙含量可增加质膜稳定性。

六、pH值

酶液的pH值对原生质体的产量和活力影响很大。因植物材料不同所要求的pH值也有差异，一般为pH 5．5～5．8。如果原生质体的供体材料是植物组织器官，酶液中应加入pH缓冲剂，以维持稳定酶液的pH值。一般添加0．05～0．1mol／L磷酸盐或3．0～5．0mmol／LMES(吗啉乙磺酸)。