5.3 剂量

5.3.1 分组

试验至少设3个受试物剂量组，1个阴性(溶媒)对照组,必要时增设未处理对照组。若试验中期需要观察血液生化指标、尸检或试验结束做恢复期观察,对照和高剂量需增设卫星组。对照组除不给受试物外,其余处理均同受试物剂量组。

5.3.2 剂量设计

5.3.2.1 原则上高剂量应使部分动物出现比较明显的毒性反应,但不引起死亡;低剂量不宜出现任何观察到毒效应(相当于NOAEL),且高于人的实际接触水平；中剂量介于两者之间，可出现轻度的毒性效应，以得出NOAEL和(或)LOAEL。一般递减剂量的组间距以2倍～4倍为宜，如受试物剂量总跨度过大可加设剂量组。试验剂量的设计参考急性毒性LD₅₀剂量、28天经口毒性试验剂量和人体推荐摄入量进行。

5.3.2.2 能求出LD₅₀的受试物，以28天经口毒性试验的NOAEL或LOAEL作为90天经口毒性试验的最高剂量组；或以LD₅₀的5%～15%作为最高剂量组，此LD₅₀百分比的选择主要参考LD₅₀剂量反应曲线的斜率。然后在此剂量下设几个剂量组，最低剂量组至少是人体推荐摄入量的3倍。

5.3.2.3 求不出LD₅₀的受试物，试验剂量应尽可能涵盖人体预期摄入量100倍的剂量，在不影响动物摄食及营养平衡前提下应尽量提高高剂量组的剂量,对于人体推荐摄入量较大的受试物，高剂量组亦可以按最大给予量设计。

5.4 试验步骤和观察指标

5.4.1 受试物给予

5.4.1.1 根据受试物的特性或试验目的,选择受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式给予。若受试物影响动物适口性，应灌胃给予。受试物应连续给予90d。

5.4.1.2 受试物灌胃给予,要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水、不溶于水的受试物可使用植物油(如橄榄油、玉米油等)，不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应新鲜配制,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。为保证受试物在动物体内浓度的稳定性,每日同一时段灌胃1次(每周灌胃6d)。试验期间，前4周每周称体重2次,之后每周称体重1次,按体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过10mL/kg体重，如为水溶液时,最大灌胃体积大鼠可达20mL/kg体重,犬为15mL/kg体重；如为油性液体,灌胃体积应不超过4mL/kg体重；各组灌胃体积一致。

5.4.1.3 受试物掺入饲料或饮水给予,要将受试物与饲料(或饮水)充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性，以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则，受试物掺入饲料比例一般小于质量分数5%,若超过5%时(最大不应超过10%),可调整对照组饲料营养素水平(若受试物无热量或营养成分,且添加比例大于5%时，对照组饲料应填充甲基纤维素等,掺入量等同高剂量)，使其与剂量组饲料营养素水平保持一致，同时增设未处理对照组;亦可视受试物热量或营养成分的状况调整剂量组饲料营养素水平,使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的毫克(或克)数，即mg/kg体重(或g/kg体重)，当受试物掺入饲料其剂量单位亦可表示为mg/kg(或g/kg)饲料,掺入饮水则表示为mg/mL水。受试物掺入饲料时,需将受试物剂量(mg/kg体重)按动物每100g体重的摄食量折算为受试物饲料浓度(mg/kg饲料)，一般90天经口毒性试验大鼠每日摄食量按体重8%折算。

5.4.2 一般临床观察

观察期限为90d,若设恢复期观察,动物应停止给予受试物后继续观察28d,以观察受试物毒性的可逆性、持续性和迟发效应。试验期间至少每天观察一次动物的一般临床表现,并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。观察内容包括被毛、皮肤、眼、黏膜、分泌物、排泄物、呼吸系统、神经系统、自主活动(如：流泪、竖毛反应、瞳孔大小、异常呼吸)及行为表现(如：步态、姿势、对处理的反应、有无强直性或阵挛性活动、刻板反应、反常行为等)。对体质弱的动物应隔离，濒死和死亡动物应及时解剖。

5.4.3 体重和摄食及饮水消耗量

每周记录体重、摄食量,计算食物利用率;试验结束时,计算动物体重增长量、总摄食量、总食物利用率。受试物经饮水给予,应每日记录饮水量。如受试物经掺入饲料或饮水给予,应计算和报告受试物各剂量组实际摄入剂量。

5.4.4 眼部检查

在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查(角膜、晶状体、球结膜、虹膜),犬用荧光素钠进行检查,若发现高剂量组动物有眼部变化,则应对所有动物进行检查。

5.4.5 血液学检查

大鼠试验中期(卫星组)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行血液学指标测定;犬试验前、试验期间(45d)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行血液学指标测定。推荐指标为白细胞计数及分类(至少三分类)、红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)等。如果对血液系统有影响，应加测网织红细胞、骨髓涂片细胞学检查。

5.4.6 血生化学检查

大鼠试验中期(卫星组)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行血液生化指标测定;犬试验前、试验期间(45d)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行血液生化指标测定，应空腹采血。测定指标应包括电解质平衡、糖、脂和蛋白质代谢、肝(细胞、胆管)肾功能等方面。至少包含丙氨酸氨基转移酶(ALT)冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、尿素(Urea)、肌酐(Cr)、血糖(GIU)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、氯、钾、钠指标。必要时可检测钙、磷、尿酸(UA)、总胆汁酸(TBA),胆减酯酶、山梨醇脱氢酶、高铁血红蛋白、激素等指标。应根据受试物的毒作用特点或构效关系增加检测内容。

5.4.7 尿液检查

大鼠在试验中期(卫星组)、试验结束、恢复期结束(卫星组)时进行尿液常规检查,犬试验前、试验期间(45d)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行尿液常規检查。包括外观、尿蛋白、密度、pH、葡萄糖和潜血等。若预期有毒反应指征,应增加尿液检查的有关项目如尿沉渣镜检、细胞分析等。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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