5.3 剂量

受试物应设三个剂量组,最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和(或)个别动物出现死亡的剂量,一般可取1/2LD₅₀，低剂量组应不表现出毒性,分别取1/4LD50和1/8LD₅₀作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量(最大使用浓度和最大灌胃容量)动物无死亡而求不出LD₅₀时，高剂量组则按以下顺序：

a)10g/kg体重；

b)人的可能摄入量的100倍；

c)一次最大灌胃剂量进行设计,再下设中、低剂量组。另设溶媒对照组。阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。

5.4 试验步骤和观察指标

5.4.1 受试物给予

经口灌胃。根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。常用30h给受试物法。即两次给受试物间隔24h,第二次给受试物后6h采集骨髓样品。试验还可以有以下2种采样方式：

a)以受试物1次给予动物。以适当的间隔采集骨髓样品至少2次,开始不早于给予后24h,最后不晚于给予后48h。早于给予后24h的采样，应说明理由。外周血采样以适当的间隔至少2次,开始不早于给予后36h,最后不晚于给予后72h。如在一个采样时间发现阳性结果，则不需要进一步采样。

b)每天1次给予，共2次或多次(间隔24h)给予，可在末次给予后18h～24h之间采集骨髓1次,对外周血可在末次给予后36h～48h之间采样1次。若选用外周血正染红细胞的含微核细胞率作为试验观察终点，动物给予的时间应达4周以上。

5.4.2 标本制作

5.4.2.1 骨髓样品：处死后取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片,或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定5min～10min。当日固定后保存。将固定好的涂片放入Giemsa应用液中,染色10min～15min。立即用PH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。写好标签，阴凉干燥处保存。

5.4.2.2 外周血样品：从尾静脉或其他适当的血管采集外周血,血细胞立即在存活状态染色或制备涂片并染色。为排除与使用非DNA染料相关的人工假象可利用DNA特异性染料(如吖啶橙或Hoechst33258加Pyronin-Y)。这种方法的好处是不会排除常用染料(如Giemsa)的使用。

5.4.3 阅片

5.4.3.1 选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，在油镜下观察。以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。

5.4.3.2 本方法系观察嗜多染红细胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色,成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐,嗜色性与核质一致,呈紫红色或蓝紫色,直径通常为红细胞的1/20～1/5。

5.4.3.3 对每个动物的骨髓至少观察200个红细胞,对外周血至少观察1000个红细胞,计数嗜多染红细胞在总红细胞中比例，嗜多染红细胞在总红细胞中比例不应低于对照值的20%。每个动物至少观察2000个嗜多染红细胞以计数有微核嗜多染红细胞频率，即含微核细胞率，以千分率表示。如一个嗜多染红细胞中有多个微核存在时,只按一个细胞计。

6 数据处理和结果评价

6.1 数据处理

按动物性别分别统计各组含微核细胞率的均数和标准差,利用适当的统计学方法如泊松(Poisson)分布或U检验,对受试样品各剂量组与溶剂对照组的含微核细胞率进行比较。

6.2 结果评价

试验组与对照组相比,试验结果含微核细胞率有明显的剂量-反应关系并有统计学意义时，即可确认为有阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量-反应关系时，则应进行重复试验。结果能重复可确定为阳性。

7 试验报告

7.1 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。

7.2 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。

7.3 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。

7.4 试验摘要。

7.5 受试物：名称、批号、剂型、状态(包括感官、性状、包装完整性、标识)、数量、前处理方法、阳性对照物的相关信息。

7.6 实验动物：物种、品系、级别、数量、周龄、体重、性别、来源(供应商名称、实验动物生产许可证号)、动物检疫、适应情况，饲养环境(温度、相对湿度、实验动物设施使用许可证号)，饲料来源(供应商名称、实验动物饲料生产许可证号)。

7.7 试验方法:试验分组、每组动物数、剂量选择依据、受试物给予途径及期限、采样时间点、标本制备方法、每只动物观察的细胞数、统计方法和判定标准。

7.8 试验结果：记录每只动物观察的嗜多染红细胞数和含有微核的细胞数，以列表方式报告不同性别每组动物的嗜多染红细胞数、含微核细胞率和嗜多染红细胞在总红细胞中的比例、剂量反应关系、阴性对照的历史资料和范围，并写明结果的统计方法。

7.9 试验结论：根据试验结果，对受试物是否能引起哺乳动物嗜多染红细胞含微核细胞率增加做出结论。

8 试验的解释

阳性结果表明受试样品在本试验条件下可引起哺乳动物嗜多染红细胞含微核细胞率增加。阴性结果表明在本试验条件下受试样品不引起哺乳动物嗜多染红细胞含微核细胞率增加。一般阴性对照组的含微核细胞率＜5‰,供参考。但应有本实验室所用实验动物的自发含微核细胞率本底值作参考。本试验方法不适用于有证据表明受试物或其代谢产物不能达到靶组织的情况。

相关链接：哺乳动物红细胞微核试验（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。