北京普天同创生物科技有限公司
6 测定步骤
6.1 提取
准确称取5g(精确至0.01g)均匀试样,于50 mL塑料离心管中,加入30 mL乙腈,2 mL异丙醇和10 mL柠檬酸缓冲溶液(3.11),在2000r/min下涡旋混合提取5 min, 4000r/min离心5 min,上清液转移至250 mL梨形瓶中。重复上述提取操作,合并提取液,加入6 mL异丙醇后在40℃±2℃的温度下旋转浓缩至5 mL左右,转移浓缩液至50 mL塑料离心管中,并用5 mL柠檬酸缓冲液(3.11)润洗梨形瓶,合并洗液,在4℃下8500r/min冷冻离心10 min(4.3),过0.45um滤膜(3.20)后待净化。
6.2 净化
将MEP柱(3.18)和MCX柱(3.19)按照从上到下顺序装好,依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL柠檬酸缓冲液(3.11)活化。转移6.1.1中样液至固相萃取柱的顶部,以0.5 mL/min流速过柱。用3 mL柠檬酸缓冲液(3.11)、3 mL水、3 mL水-甲醇溶液(3.13)淋洗柱,抽干5 min后,依次用4 mL甲醇和6 mL甲醇-氨水溶液(3.12),洗脱柱上的待分析成分,合并收集洗脱液,在氮吹浓缩装置上于40℃±2℃的温度下蒸干。加入1.0 mL含0.1%甲酸的水-甲醇(3.13)溶液振荡溶解残渣后,过0.22 um滤膜(3.20)滤液供液相色谱-质谱测定。
6.3 测定
6.3.1 高效液相色谱条件
a)色谱柱:C18柱,150 mm×4.6 mm(内径),粒径3.0 um或相当者;
b)流动相:A:含0.1%甲酸的乙腈,B:含0.1%甲酸2 mmol/L乙酸铵水溶液+甲醇(95+5,体积比);流速:600uL/min,梯度洗脱程序见表1;
表1 梯度洗脱程序表
c)柱温:35℃;
d)进样量:20 uL。
6.3.2 质谱条件
a)离子源:电喷雾ESI,正离子;
b)扫描方式,多反应监测MRM;
c)雾化气(GSl)、气帘气(CUR)、辅助气(GS2)、碰撞气(CAD)均为高纯氮气或其他合适气体;使用前应调节各气体流量以及离子源温度(TEM)使质谱灵敏度达到检测要求。
d)电喷雾电压(IS)、碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)应优化至最佳灵敏度。
6.3.3 定量测定
根据试样中被测物的含量情况,选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析,标准曲线工作液应有5个浓度水平,应包括零点。基质标准工作液和待测液中76种药物的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过线性范围,应用基质空白溶液稀释到合适浓度后分析。
6.3.4 定性测定
按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液,如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品一致,定性离子对的相对丰度,是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示,应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致,相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围,则可判断样品中存在对应的被测物。
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
6.4 空白试验
除不加试样外,均按上述操作步骤进行。
7 结果计算和表述
用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中药物的残留含量,计算结果需扣除空白值:
式中:
Xi—试样中药物残留量,单位为微克每千克(ug/kg);
ci—从标准曲线上得到的药物残留量的溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);
V—样液最终定容体积,单位为毫升(mL);
m—最终样液代表的试样质量,单位为克(g)。
文章来源:《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》
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