北京普天同创生物科技有限公司
7 分析步骤
7.1 提取
称取1g试样,精确到0.01g,置于20 mL具塞试管中,加入9 mL缓冲溶液(4.2)于液体混匀器上快速混匀1 min,使试样完全溶解,以3000r/min离心10 min后,取适量的样品上清溶液用注射过滤器过滤至10 mL的具塞试管中,供酶标仪测定。此溶液稀释系数为10。
7.2 测定条件
以下所有操作应在20℃~24℃室温下进行。
7.2.1 酶标仪测定条件:酶标仪测定波长为450 nm。
7.2.2 人工洗板条件:洗涤次数五次以上,每次注水量为250uL。
7.2.3 泰乐菌素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20℃~24℃)后方可使用。
7.2.4 将测定需用的微孔板(4.1.1)备齐并插入微孔架上,记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。
7.3 测定
测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。
7.3.1 分别吸取50uL泰乐菌素标准工作溶液(4.3)和样品溶液等,按模板图位置依次加入各自的微孔底部。
7.3.2 分别吸取100uL泰乐菌素酶标记物溶液(4.4)于每一个微孔底部,然后,用封口膜密封孔口以防溶液挥发。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后,于20℃~24℃避光孵育10 min。
7.3.3 倒出孔中的液体,将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打,以除去孔中过多的残液,但不能使微孔干燥,然后,立即用洗板工作溶液(4.5)按7.2.2要求进行洗板,每次弃去洗板溶液后,均应将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打,以除去孔中过多的残液,但不能使微孔干燥。
7.3.4 迅速加入100uL显色剂(4.1.7)于每一个微孔底部,然后,持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后,于20℃~24℃避光孵育10 min。
7.3.5 迅速加入100uL反应停止液(4.1.8)于每一个微孔底部,然后,持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后,将微孔架置于酶标仪中,在450 nm处测量吸光度(加入反应停止液后应在60 min内读取吸光度)。
7.4 平行试验
按以上步骤,对同一标准、同一样品溶液均应进行平行试验测定。
7.5 空白试验
除不称取试样外,均按上述步骤进行。
7.6 监控试验
每次测定均应做一个添加泰乐菌素标准的显色剂样品。
8 结果计算
在半对数坐标纸上,以吸光度值为纵坐标(%),泰乐菌素标准工作溶液浓度(ug/L)为横坐标,绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的泰乐菌素浓度后,结果按公式(1)计算:
式中:
X—试样中泰乐菌素残留量,单位为微克每千克(ug/kg);
c—从标准工作曲线上得到的试样中泰乐菌素浓度,单位为微克每升(ug/L);
V—样品溶液的体积,单位为毫升(mL);
m—样品溶液所含的试样质量,单位为克(g)。
结果表示到小数点后两位。
注:计算结果应扣除空白值。
9 确证试验
如被测样品中泰乐菌素残留量的值大于检出限时,应用LC-MS-MS法进行确证。
10 精密度
本部分的精密度数据是按照GB/T 6379的规定确定的,其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。
10.1 重复性
在重复性条件下,蜂蜜中泰乐菌素的含量在10.0ug/kg~100.0ug/kg范围时,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r),本部分的重复性限按方程式(2)计算:
1gr=1.285 5 1g m-1.7529······(2)
式中:
m—两次测定值的平均值,单位为微克每千克(ug/kg)。
如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。
10.2 再现性
在再现性条件下,蜂蜜中泰乐菌素的含量在10.0ug/kg~100.0ug/kg范围时,获得的两次独立侧试结果的绝对差值不超过再现性(R),本部分的再现性限按方程式(3)计算:
R=0.1217m+0.7176······(3)
式中:
m—两次测定值的平均值,单位为微克每千克(ug/kg)。
文章来源:《常用兽药残留量检测方法》
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