建立一个灵敏、准确、可靠、耐用的HPLC方法的主要步骤包括：

收集样品信息，根据产品生产工艺和结构特点推测可能存在的工艺杂质以及降解产物，了解各化合物的理化性质，如样品分子量的大小、酸碱性和pK_a、pK_b 值、溶解性、紫外吸收特征、样品状态(离子状态还是非离子状态)等，以选择合适的色谱分离模式。

在色谱分离模式选定之后，就须确定分离的色谱条件，各分离模式虽各有特点，但不外乎色谱柱、流动相、检测波长、柱温、流动相流速、等度或梯度洗脱等。

对于国内外标准中都收载了HPLC分析方法的药品，应注意该方法是否适合用于待测的产品。可根据原料药的合成路线或制剂工艺的具体情况，以药典方法作为模板，对其进行适当优化。

检测方法建立后，须对所建立的方法进行方法学验证，并在标准中规定灵敏度、分离度等系统适用性试验要求，明确杂质的计算方式以及限度。下面就有关物质HPLC检查方法的建立以及方法验证中常见的一些问题进行探讨。

(一)有关物质检查用HPLC检查方法的建立

1．样品来源及工艺由于生产工艺的差异，药品杂质的情况也不同，比如醋酸泼尼松龙，A、B两家药厂的工艺不同，采用《英国药典》(简称BP)中收载的醋酸泼尼松龙有关物质检查的色谱条件对产品进行分析，结果见表14-2。分析数据显示B厂产品比A厂产品多检出3个杂质，A厂产品纯度高于B厂，总杂质量相差接近0.5%。

表14-2 不同来源的产品及不同检验方法对分析结果的影响

采用《中国药典》醋酸泼尼松龙有关物质检查的色谱条件进行分析，结果与BP方法相反，A厂产品的杂质个数及杂质总量都高于B厂，杂质总量相差接近0.5%。

上面的数据表明，一个色谱条件很难将所有可能的杂质全部分离，不同来源的产品应当采用相应的方法进行分析。即使是国家药品标准，一个质量标准也只适用于一种或几种工艺生产的产品质量分析。如果可能，分析人员应对样品的来源及工艺条件做必要的了解。

2．药物中的酸根相当一部分药品以有机酸盐的形式存在，比如马来酸氯苯那敏、双羟茶酸噻嘧啶、枸橼酸他莫昔芬、苯磺酸氨氯地平等。HPLC法有关物质检查中，除碱基外某些有机酸也出峰，在特定波长下这些有机酸的吸收较小，容易被当做杂质进行处理。因此对此类药物的杂质分析中，应增加有机酸的进样，确定其色谱峰的位置，避免分析中错判为杂质。

除某些有机酸外，一些无机酸根离子也会出峰，比如硝酸根，硝酸毛果芸香碱和硝酸咪康唑的有关物质检查中，除了溶剂峰外，还有保留时间很短的色谱峰，与硝酸钾的色谱峰一致，硝酸钾通常被用来测定死时间。

3.溶剂峰和不保留杂质的区分进行有关物质检查时，通常是从空白溶剂峰之后对检出的色谱峰进行积分，对溶剂峰之前的色谱峰不考虑。因为杂质的性质可能与主成分一致也可能相差很大，表现在色谱行为上就是保留时间的差异，这也是进行有关物质测定的依据。如果样品色谱图中，在空白溶剂峰之前有色谱峰，不能简单地将其忽略不计，比如盐酸二甲弗林有关物质检查中，在溶剂峰之前有一色谱峰，在空白溶剂色谱图中未见此峰，取0.1%盐酸进样，也末见此峰，该色谱峰的紫外吸收光谱也说明不是氯离子的色谱峰。因此不能排除此峰为不保留的极性杂质。

4．检测波长的选择由于有关物质检查的对象是杂质，波长选择时应以关注杂质的检出为主，若随意地将主成分最大吸收波长设定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低，或者没有吸收，这样会导致对杂质含量的低估甚至漏检。如果有杂质对照品，可利用紫外-可见分光光度计扫描得到被测组分的最大吸收波长或特征波长，利用紫外-可见分光光度计进行扫描时制样溶剂应与流动相一致，当然采用DAD检测器进行波长选择更为便利。

检测波长选择时应综合考虑主成分与主要杂质的吸收特性，既要保证主要杂质在此波长下有较高的灵敏度，又要尽量减小有关物质与组分之间相应的差异，如果杂质与主成分吸收系数相差较大，可用加校正因子或采用杂质对照品的方法对杂质进行检查。在有些情况下，如不同杂质之间的紫外吸收差异很大，无法在同一波长下测定，可采用多个波长同时检测的方法，在不同的波长下检测不同的杂质，例如磷酸呱喹的有关物质测定，杂质Ⅱ检测波长为317nm，而杂质I、杂质Ⅲ及其他未知杂质则以349nm作为检测波长。

文章来源：《实用化学药品检验检测技术指南》

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