色谱分离法(一)
来源/作者:中国标准物质网  日期:2018-11-12

12.6.1色谱法基本原理

色谱法是一种重要的分离、分析方法,它是利用不同物质在两相中具有不同的分配系数,当两相做相对运动时,这些物质在两相之间进行多次反复分配,使分配系数只有微小差别的物质实现分离。在色谱技术中,流动相为气体的叫气相色谱,流动相为液体的叫液相色谱。固定相可以装在柱内,也可以做成薄层。前者叫柱色谱,后者叫薄层色谱。根据色谱法原理制成的仪器叫色谱仪,目前,主要有气相色谱仪和液相色谱仪。

图12-8所示为气相色谱仪的一般流程示意图。气相气相色谱仪一般由载气源(包括压力调节器、净化器)、进样器(也可称为气化室)、色谱柱与柱温箱、检测器和数据处理系统构成。进样器、柱温箱和检测器分别具有温控装置,可达到各自的设定温度。最简单的数据处理系统是记录仪,现代数据处理系统都是由既可存储各种色谱数据,计算测定结果,打印图谱及报告,又可控制色谱仪的各种实验条件,如温度、气体流量、程序升温等的工作站处理,一般而言这些工作站由计算机和专用色谱软件组成的。

图12-8 气相色谱仪的一般流程示意图

以液体为流动相,采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。现代高效液相色谱仪的种类很多,根据其功能不同,可分为分析型、制备型和专用型。无论高效液相色谱仪在复杂程度以及各种部件的功能上有多大的差别,就其基本原理而言是相同的,一般由5部分组成,分别是输液系统、进样系统、分离系统、检测系统以及数据处理系统。图12-9所示为高效液相色谱仪的仪器结构图。

图12-9 高效液相色谱仪仪器结构图

柱色谱、纸色谱和薄层色谱的分离床是开放的,分离和检测是相对独立的,是实验室常见的简便易行的分离和鉴定方法。

气相色谱和高效液相色谱的色谱柱是封闭的,它们将高效分离和高灵敏检测有机结合起来,实现分离分析一体化,特别适用于混合物和复杂样品分析。

12.6.2色谱分离法的分类与特点

色谱分离的分类方式有很多种。

按色谱的机理分,色谱分离可分为亲和色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、疏水色谱等几种。按操作形式不同,色谱分离可分为3种分别是纸色谱、柱色谱、薄层色谱。色谱法按两相所处的状态可分为液-固色谱、液-液色谱、气-固色谱、气-液色谱。用液体作为流动相,称为“液相色谱”;用气体作为流动相,称为“气相色谱”。固定相也有两种状态,以同体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相。不同的色谱分离技术在其分离原理、应用范围、分离效率、操作条件、适用阶段等方面都有一定的差异,具体的选择方案要通过实验、研究最终做出最为合适的选择。

色谱分离是一种物理的分离方法,它是利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同的程度分布在两个相中。其中一相是固定相,通常为表面积很大的或多孔性固体;另一相是流动相,是液体或气体。当流动相流过固定相时,由于物质在两相间的分配情况不同,经过多次差别分配而达到分离,或者说,易于分配于固定相中的物质移动速度慢,易于分配于流动相中的物质移动速度快,于是逐步分离。该方法与其他分离纯化方法相比,具有如下基本特点:分离效率高、应用范围广、选择性强、操作简单、方便等优点。与一般的分离技术相比,色谱法也存在着一些缺点如处理量小、操作周期长、不能连续操作,在用色谱法纯化之前一般都需要经过其他方法的初步提取、纯化,因此主要用干实验室,工业生产上应用较少。

12.6.3离子交换色谱(IEC)

离子交换色谱法是利用离子交换树脂作为固定相,以适宜的溶剂作为移动相,使溶质按它们的离子交换亲和力的不同从而发生分离的方法。如今,离子交换介质得到了很大的发展,尤其为适应工业化大生产及高压液相色谱对压力和流速的要求而开发的刚性好的颗粒介质,使这一技术得到了更加广泛的应用。

离子交换色谱是以离子交换剂为固定相,以含特定离子的溶液为流动相,利用离子交换剂上的可交换离子与溶液中离子发生交换作用,由于不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同,在经过洗脱液过程后,样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱,而将混合物中不同离子进行分离的技术。也可说带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离的技术。其中两性电解质如蛋白质氨基酸等在不同的溶液当中所带的净电荷的种类和数量是不同的。

当某溶液中的某种两性电解质所带正负电荷数正好相等,即净电荷数为零时,该溶液的pH称为此两性电解质的等电点PI。大部分蛋白质的PI值都在5~9之间。若溶液pH大于高于蛋白质的PI,则蛋白质带净负电荷;反之则带净正电荷。溶液pH和pI相差越大,蛋白质等分子所带的净电荷量越大。而由于各种蛋白质的等电点不同,故可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响其与离子交换树脂的吸附作用,从而将它们相互分离开来。

离子交换剂也称为离子交换介质,为离子交换色谱的固定相。可根据材料的不同,将其划分为:①聚苯乙烯型离子交换树脂。树脂骨架的多孔弹性颗粒;②多糖类骨架的离子交换树脂。如离子交换纤维素、离子交换葡聚糖等。根据根据活性基团的不同可分为:①阳离子交换剂如-SO3H2、-PO3H2、-COOH等;②阴离子交换剂如-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2等。

文章来源:《分析化学分析方法的原理及应用研究》

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【关键词】基酸 蛋白质 聚苯乙烯 中国标准物质