12.6.4凝胶色谱技术(GPC)

凝胶色谱技术又称为空间排阻色谱法(SEC)，也称为分子排阻色谱法，是20世纪60年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，在对高分子物质有显著的分离效果。目前已被广泛用于生化学、分子免疫学以及医学等有关领域。

凝胶色谱法系指其所用的固定相是称为凝胶的多孔性填料。混合物随流动相经固定相(凝胶)的色谱柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。固定相是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小分子可进入凝胶网孔，而大分子则排阻于凝胶颗粒之外。整个色谱过程一般不变换洗脱液。其原理如图12-10所示。

图12-10 凝胶色谱分离法原理

将有一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用流动相洗脱，大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，因此大分子在凝胶床内移动距离较短，在洗脱时向下移动的速度较快。而中等大小的分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，但不能深入，凝胶对其阻滞作用不强，将会在大分子之后被洗脱下来。最后小分子物质能够进入凝胶相内，在向下移动的过程中，会由一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，易知小分子物质的下移速度小于前两种物质，最后出柱如图中所示。这样混合样品在经过色谱柱后，各组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱，从而实现分离的目的。

根据流动相的不同，凝胶色谱分离法可分为以有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱法(GFC)和以水或缓冲液为流动相的凝胶过滤色谱法(GPC)。GFC有如硅胶和玻璃珠等无机填料，琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酞胺凝胶等，适用于水溶性高分子的分离。GPC所用填料有聚苯乙烯凝胶、聚乙酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸酯凝胶等，主要适合于脂溶性高分子的分离。总的来说凝胶色谱法具有操作方便，不会使物质变性，适用于不稳定的化合物，凝胶无须再生，可反复使用等优点，在生物制药中占有重要的位置。

凝胶色谱法中凝胶是其核心，是产生分离的基础。通常用于色谱分离的凝胶需满足以下几点：①具有一定的孔径分布范围；②较高机械强度，允许较高的操作压力；③化学稳定性强，在很宽的pH和温度范围内不起化学变化，不分解，使用寿命长；④在分离过程中不与被分离物质发生结合，凝胶骨架在化学上为惰性；⑤本身应是中性物质，不含有或仅含有最少量能解离的基团，不会产生离子交换现象。

12.6.5亲和色谱(AFC)

亲和色谱是指利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进行的色谱方法，专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力来进行相互分离的。

生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性，如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、核糖核酸和其互补的脱氧核糖核酸等。生物分子之间这种特异的可逆性结合能力称为亲和力，利用生物分子之间专一的亲和力进行分离纯化的色谱方法，称为亲和色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基，如抗原和抗体。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。

图12-11所示为亲和色谱分离原理，把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物活性功能的情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱中如图(a)状态，然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基与目的物质形成配合物的条件下进入色谱柱。这时，混合液中只有能与配基发生结合反应形成配合物的目的物质图目标产物分子被吸附即图(b)状态，不能发生结合反应的杂质分子图中杂蛋白分子会直接流出。经过清洗后，选择适当的洗脱液或改变洗脱条件进行洗脱如图(c)所示，使被分离物质与固定相配基解离，最终将目标产物分离纯化。

图12-11 亲和色谱分离原理
(a)进料吸附；(b)清洗；(c)洗脱；(d)再生
·—目标产物：△—杂蛋白

通常需要根据目标产物选择适合的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的固定相。固体粒子称为配基的载体。亲和色谱的载体物质应具有以下特性。

①不溶性的多孔网状结构及良好的渗透性，以便大分子物质能够自由进入。

②较高的物理化学稳定性、生物惰性及机械强度，最好为粒径均匀的球形粒子，以便能耐受亲和、洗脱等处理并且保证良好的流速，提高分离效果，延长使用寿命。

③亲水性及水不溶性，无非特异性吸附。载体的亲水性常常是保证被吸附生物分子稳定性的重要因素之一。

④含有可活化的反应基团，有利于亲和配基的固定化。

⑤能够抵抗微生物和酶的侵蚀。

常见载体有经济、易得且非特异吸附严重的纤维素，耐酸、碱、有机溶剂及生物侵蚀的多孔玻璃，良好稳定性的葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。

相关链接：色谱分离法（一）

文章来源：《分析化学分析方法的原理及应用研究》

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