(三)PCR反应参数

在PCR反应中每轮循环的各步反应时间不应过长，以免降低TagDNA聚合酶的活力。下面介绍PCR反应中的一些具体参数。

1.变性

在第一轮扩增前使DNA完全变性十分重要，因此一般反应中都先在94℃变性5 min，然后再加入TagDNA聚合酶进行扩增。变性不完全往往使PCR反应失败，因为未完全变性的DNA会很快复性，减少DNA的产量。DNA变性一般仅需要几秒钟即可完成，反应中变性所需的时间主要是为使整个反应体系达到合适的变性温度。变性时温度过高或时间过长，都会导致酶活力的降低。TagDNA聚合酶活力的半衰期为：92.5℃,130min; 95℃, 40min;97℃，5min。典型的变性温度和时间为94℃，1 min或97℃，15s。

2．退火

引物退火温度和所需时间长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的匹配程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量较高，长度较长并且与模板完全匹配，则应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性也越高。有些反应甚至将退火和延伸反应合并，只用两种温度完成整个扩增循环(例如用60℃和94℃)，这既节省了时间，又提高了特异性。

在典型的引物浓度(0.2mol/L)下，由于引物过量，退火仅需数秒钟即可完成。反应中所需的退火时间主要是为了使整个反应体系达到合适的温度。典型的退火温度和时间为50℃和2min。

3．延伸

延伸反应通常在72℃下进行，接近TagDNA聚合酶的最适反应温度75℃，实际上引物延伸在退火时已经开始，因为TagDNA聚合酶的作用温度范围为20～85℃，延伸反应时间的长短取决于目的序列的浓度和长度。在一般反应体系中TagDNA聚合酶每分钟可合成1kb长的DNA。对于极长的片段延伸时间可达15min，但使用更长的时间则对扩增产物已没有影响。在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延伸反应的时间以减少TagDNA聚合酶活力的降低。典型延伸反应的温度和时间为72℃和1～3 min。一般在扩增反应完成后都需要有一步长时间(通常为10～30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的扩增产物，这对以后进行克隆和扩增产物测序极为重要。

4．循环次数

当其他参数确定之后循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物严重出错，非特异性产物大量增加。一般经25～30轮循环后，DNA聚合酶已经严重不足，不能进行扩增，如果此时产物产量还不够，需要进一步扩增，则可将扩增的DNA样品稀释103～105，倍作为模板，重新加人各种反应底物进行扩增反应。这样经60轮循环，扩增水平可达109～1010，但要注意此时非特异性产物的量也会大量增加。不同起始目的DNA分子数与所用的PCR循环次数的关系如表5-7所示。

表5-7 起始目的DNA分子数与所用的PCR循环次数的关系

在扩增反应后期合成产物的量达0.3～1 pmol时，由于产物积累使原来以指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环次数而明显上升，这称为平台效应。平台效应取决于下列因素：①尚可利用的底物浓度(dNTP或引物浓度)；②反应中存在的酶活力；③最终产物的反馈抑制(焦磷酸或双链DNA) ;④非特异性产物或引物二聚体与反应模板的竞争；⑤在高浓度产物下产物的变性和链分离不能完全，或者大量特异性产物重新退火(从而降低有效的模板数或者使延伸反应出错)；另外平台期会出现原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增达到较高水平。因此适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物出现。现在有一种PCR只需10多分钟即可完成20轮循环，它利用热传递很快的毛细管，减少了反应中为使整个反应体系达到合适温度所需要的时间，从而提高反应效率。

(四)常见PCR种类

1．热启动PCR

原理和特点：在传统PCR反应中除一种主要反应试剂(dNTP或TagDNA聚合酶或引物外)，其他反应成分一次性加入，当程序性升温达到70℃以上时再将反应管放在PCR扩增仪上进行扩增，这样既可以减少非特异性扩增产物的出现，又可以减少引物二聚体的形成。

2．一步单管PCR

该方法主要用于RNA病毒等的检测，一种方法是首先用化学方法提取核酸，接下来将cDNA及PCR反应放在一个反应管中，在PCR扩增仪上一步进行。近年来又有入将热裂解释放核酸方法用于提取病毒RNA提取，使RNA的提取、反转录和PCR在一个反应管中一步进行，这样既减少了操作步骤，又最大限度地减少了环境核酸和核酸酶造成的污染，使特异性及敏感性都有所增加。

3．多重PCR

多重PCR原理与常规PCR相同，只是在反应体系中加入一对以上的特异性引物，如果存在与特异性引物对互补的模板，则可同时在同一个反应管中扩增出一条以上的DNA片段，这种方法既保留了常规PCR的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂，实现了一次扩增就能同时检测多种微生物的目的。

4．依赖PCR的DNA指纹图谱技术

通过各种改进的PCR技术使目标微生物的核酸经扩增后产生多条DNA扩增片段(包括特异性的和非特异性的)，通过统计分析找出某种微生物的特有条带进行区别鉴定。其特点是即使在事先不知道目的微生物核酸序列的前提下，也可以对其进行检测和鉴定。

5.PCR-单链构象多态性分析

1989年才真正建立起PCR-单链构象多态性分析技术，一般用于基因突变的检测，主要用于癌基因或抗癌基因的检测分析。在微生物检测方面只有Wdjoioatmodj。等1994年将其用于细菌的快速鉴定，他们采用两对保守引物分别用于16SrRNA基因两侧，产物为216bp和255bp的基因片段，扩增检测了15个属40个种的100多个代表菌株，能较好地将这些菌分离开来，产物检测时需要注意电泳温度和电泳缓冲液离子强度的变化：该方法灵敏度更高，可检测到只有一个碱基的突变和差异；不需要酶切，直接对产物进行随机多态性分析，操作简便，无需专门仪器。

6.mRNA差异显示技术

mRNA差异显示技术主要用于真核细胞mRNA差异的表达，为寻找未知基因提供了新途径，但将其应用于未知微生物的检测和鉴定目前尚未报道。

7．随机引物扩增DNA多态性(RAPD)

这种技术主要用于在不考虑微生物核酸精确序列的前提下比较微生物间的DNA指纹图谱差异，具有种特异性和同种不同株间的特异性，且重复性较好。RAPD技术近年来已被广泛用于细菌种间的鉴定；此外该技术也被用于真菌和酵母等的检测与鉴定，RAPD技术的关键是引物的筛选和实验条件的优化。

8.以微卫星DNA介导的PCR技术

微卫星DNA又称简单重复序列，它广泛存在于原核和真核生物基因组中，其中最常见的是双核苷酸重复，即(AC)n和(TG)n，该技术可作为RAPD技术的一个特例，区别在于其引物不是完全随机的，因此扩增引物的条带组成比RAPD的要稳定。目前这一技术已被用于真菌等的检测，但用于其他微生物的分型和检测尚未见报道。

9．基因间重复性回文片段(REP)和基因内重复性一致序列(ERIC)的扩增

Versalovic以与REP和ERIC重复序列配对互补的寡核苷酸片段作为PCR扩增的引物及斑点杂交的探针来检测真细菌属中的不同菌，包括大肠杆菌、布鲁杆菌和假单孢菌等，扩增产物在琼脂糖凝胶上形成清晰的DNA条带，而且在不同的真细菌属、种之间都存在特异的DNA指纹图谱。除引物序列固定外，其他与RAPD一致，且结果的重复性更好。

10．扩增片段长度多态性分析(AFLP)

1995年Vos等建立了这一技术并将其用于λDNA、植物病毒DNA、细菌DNA及植物DNA等的检测，结果较好。要想得到有价值的图谱，选择合适的核酸内切酶是关键。该法与RAPD等技术相比，具有稳定性高，重复性好等优点。目前尚未见进一步报道。

11．限制性长度多态性分析(RFLP)

此方法基于在PCR扩增产物的片段内含有限制性酶切位点，扩增产物经酶切后在电泳凝胶上可分出特定的条带。若酶切位点发生变异，则不能被酶切，电泳图谱将发生改变，以此可对微生物进行检测和分型。只要待扩增片段选择得当，则扩增产物图谱重复性较好，否则若变异点不在酶切位点，其区分能力就受到限制或完全丧失。Selenska-Pobell等对RELP技术、RAPD技术及肠道细菌重复性回文片段扩增技术进行了比较。在检测根瘤菌方面，后两种技术具有较明显的优势：简单、快速且分辨率较高。

12．用于RNA病毒检测的核酸扩增技术

TthDNA聚合酶介导的核酸扩增技术：TthDNA聚合酶来源于嗜热真菌，为一耐热的DNA聚合酶，此酶为一高度加工的5'～3'聚合酶，不仅有与TagDNA聚合酶同样的DNA聚合作用，而且具有反转录活性C利用其这种特性可以对其RNA病毒进行检测。

目前微生物的分子生物学检验主要采用改进的PCR技术、尤其是DNA指纹图谱技术近年来得到了快速发展。对于一种未知微生物一般应先采用通用引物多重PCR技术鉴定出种、属，再用DNA指纹图谱技术进一步分型，同时应用这一技术还有可能发现新的未知微生物。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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