淀粉类食品在高温(>120℃)烹调下容易产生丙烯酞胺，尤其在过度油炸和烧烤时产生量最多。已有的研究表明，过量或长期食用高含量丙烯酰胺的食品，有一定的安全隐患。目前虽尚未对食品中丙烯酰胺制定限量标准，但国家颁布了测定方法标准(GB 5009.204-2014)，该标准规定有“稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法”和“稳定性同位素稀释的气相色谱-质谱法”。这两种方法定性、定量准确，但对仪器要求较高，并需要¹³C₃-丙烯酰胺内标，不适合普通实验室推广应用，也不方便本科生实验教学。本试验介绍HPLC法检测丙烯酰胺。

(一)测定原理

食品中丙烯酰胺经水萃取、膜过滤和柱分离，在HPLC用外标法进行测定。该方法操作简单、快捷。

(二)试剂和仪器

1.试剂

丙烯酰胺标准品、甲醇(色谱级)、超纯水。

标准储备液：精确称取丙烯酰胺标准品(精确至0.1mg)，用甲醇定容配制成1000mg/L的标准储备溶液，存放于-20℃水箱中。丙烯酰胺的标准应用液浓度为10mg/L水溶液(临用新配)。

2．仪器与设备

高效液相色谱仪、C₁₈固相萃取柱(20cm×4.6mm, 5um)、固相萃取装置、高速离心机、漩涡混合器、0.45um PVDF滤膜、均质器。

(三)实验步骤

1．样品前处理

准确称取0.5～2g均质后的样品于30mL离心管中，加入10mL蒸馏水，均质30s。离心10min(12000r/min)，收集一次上清液，在沉淀中再加入10mL蒸馏水，均质后再离心10min (120001/min )，收集2次上清液。沉淀中再加入10mL蒸馏水，均质后再离心10min(12000r/min)，收集3次上清液。用带针头的注射器避开油层吸取收集上清液体中间清液5mL，过0.45 um PVDF滤膜过滤，取2mL滤液过固相萃取柱，弃去最初的0.5mL流出液，收集生成的流出液，用2 mL水洗脱，收集洗脱液，供进样测定。

2. HPLC测定及计算

(1) HPLC测定条件流动相：甲醇：水＝5:95(体积比)；流速：1.0mL/min ;进样量：20uL；柱温：40℃；UV检测器(检测波长：210nm)。

(2)制作标准曲线将标准应用液分别配制为0.005、0.01、0.02、0.2、1.0 ug/mL不同浓度的丙烯酰胺标准溶液进行分析，以质量浓度ng/mL为横坐标，峰面积或峰高为纵坐标绘制标准曲线。

(3)计算根据样品及标准品的保留时间定性分析和峰面积或峰高定量，将样品色谱图中丙烯酰胺对应的峰面积或峰高带入标准曲线中，计算出结果。

(四)注意事项

(1)用带针头的注射器吸取离心上清液时应尽量避开油层。但如果是油炸食品，油层可能较厚，此时可事先用正己烷提取1次可以除掉大部分油脂，以防止油脂的干扰。

(2)滤膜过滤液过C₁₈固相萃取柱时，C₁₈柱最好用5 mL水和5 mL甲醇预先活化。另外，洗脱液要自然流出，不用加压。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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