(三)检测步骤

1．硫代葡萄糖苷的提取

分别称取200.0mg待测试样至A、B两支离心管中。将离心管于75℃水浴1.0min，加入2.0mL沸甲醇-水溶液(70+30)后，立即加入200uL 5 mmol/L内标溶液至A管中，200 uL 20 mmol/L内标溶液至B管中。75℃水浴10min，其间每隔2min取出离心管在旋涡混合器上旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温，5000×g离心3min，分别转移上清液至10mL刻度试管A'、B'中。

分别向A、B管中再加入2.0mL 70％沸甲醇-水溶液(70+30), 75℃水浴约30s,涡旋混匀后，75℃水浴10min，其间每隔2min取出涡旋混合，取出离心管冷却至室温，5000g离心3 min，分别转移上清液至原刻度试管A', B'中。用水调节A'、 B'管中的提取液至5.0mL,混匀。此提取液在低于-18℃的暗处可保存2周。

2．离子交换柱的制备

将聚丙烯离子交换柱垂直置于试管架上。取0.5 mL充分混匀的葡聚糖凝胶悬浮液至每一离子交换柱中(勿黏附柱壁)。静置待液体排干后，取 2.0mL 6mol/L甲酸咪唑溶液冲洗树脂，排干后，再用1.0mL水冲洗树脂两次，每次均让水分排干。

3. 纯化、脱硫酸根

取1.0mL提取液缓缓加入已准备好的离子交换微柱中(勿搅动表面)，待液体排干后，分别加入1 mL 0.02mo1/L醋酸钠溶液两次，每次加入后均让液体排干。加入100pL硫酸酯酶溶液至离子交换微柱，35℃条件下反应16h。分别用1.0mL水冲洗离子交换微柱2次，洗脱液收集于试管中。用水将洗脱液定容至5.0mL，充分混匀后，用0.45um的微孔滤膜过滤，待进样。洗脱液在-18℃暗处可存放1周。

4．空白试验

用相同的样品进行相同的前处理，但不加内标物质，以检定样品中内标物质是否存在。

5．色谱测定

(1)仪器条件流动相流速为1.0mL/min，柱温30℃,紫外检测器检测波长229nm。

(2)洗脱梯度不同有分离柱，洗脱梯度不同。Spherisorb C₁₈柱，10um(150mm×4mm)和Novapak C₁₈柱，5um(150mm×3.9mm)，洗脱梯度见表4-4 - LichrosorbRp,、柱，5Km(150mm×6mm)，洗脱梯度见表4-5。Lichrospher Rp₁₈柱，5 um(125mm×4mm)，洗脱梯度见表4-6。

表4-4 Spherisorb C₁₈ 柱和Novapak C₁₈ 柱洗脱梯度

表4-5Lichrosorb R_pl8 柱洗脱梯度

表4-6Lichrospher R_p8柱洗脱梯度

(3)色谱测定进样量10 uL，记录峰面积。内标法定量。

6．结果计算

(1)单组分硫代葡萄糖苷含量的计算

①以每克干基脱脂油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的物质的量(umol)表示，按下式计算，计算结果精确到小数点后两位。

式中D₁—干基脱脂油菜籽中硫代葡萄糖苷含量的数值，umol/g;

A_g—硫代葡萄糖苷峰面积；

A—内标峰面积；

K_g—脱硫硫代葡萄糖苷相对校正系数，如表4-3所示；

m—试样质量，g;

n—试样中加入内标物的量，umol ;

w—试样中水分、挥发物和含油量之和，％。

②以每克脱脂油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代葡萄糖苷的物质的量(umol)表示，按下式计算，计算结果精确到小数点后两位。

式中A_g、A_s、n、m、K_g 、w同上式；

D₂—脱脂油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖苷的含量，umol/g;

W_t—标准水分及挥发物含量，以质量分数表示，数值为8.5％或9%

③以每克干基油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的物质的量(umol)表示，按下式计算，计算结果精确到小数点后两位。

式中A_g、A_s、n、m、K_g同上式；

D₃—干基油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，umol/g ;

W_t—试样中水分及挥发物含量的数值，％。

④以每克油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代葡萄糖苷的物质的量(umol/g)表示，按下式计算，计算结果精确到小数点后两位。

式中A_g、A_s、n、m、K_g、W_t、W_s同上式；

D₄—油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖苷的含量的数值，umol/g。

(2)硫代葡萄糖苷含量的计算硫代葡萄糖苷含量等于单组分硫代葡萄糖苷(单组分峰面积应大于峰面积总和的1%)含量的总和，以每克样品中所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示。如果A、B两管硫代葡萄糖苷含量的测定值满足下列精密度的要求，硫代葡萄糖苷的含量为两测定值的算术平均值。计算结果精确到小数点后两位。

精密度要求：

①同一试样、同一方法、同一操作者、同一仪器、同一实验室短期内两次测定值：如果硫代葡萄糖苷含量低于20.00 umol/g，绝对差值不大于2.00 umol/g；如果硫代葡萄糖苷含量在20.00～35.00umol/g范围内，绝对差值不大于4.00umol/g；如果硫代葡萄糖苷含量大于35.00umol/g，绝对差值不大于6.00 umol/g。

②同一试样、同一方法、不同操作者、不同仪器、不同实验室两次测定值：如果硫代葡萄糖苷含量低于20.00umol/g，绝对差值不大于4.00 umol/g ;如果硫代葡萄糖苷含量在20.00～35.00umol/g范围内，绝对差值不大于8.00umol/g；如果硫代葡萄糖苷含量大于35.00umol/g，绝对差值不大于12.00 umol/g。

相关链接：蔬菜中硫代葡萄糖苷（一）

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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