一、水溶性维生素的分析

1．方法原理

水溶性维生素皆为强极性有机化合物，可用C₁₈反相键合相色谱柱实现完全分离。

用反相离子对色谱分离水溶性维生素如图9-72所示。

图9-72  反相离子对色谱分离水溶性维生素
1-维生素C; 2-维生素B₁；3-维生素B₆；4-烟酸；5-维生素K₃(亚硫酸氢钠
甲基萘醌)；6-烟酰胺；7-对羟基苯甲酸；8-维生素B₁₂ ; 9-维生素B₂

2．色谱分析条件

(1)色谱柱Biophase ODS(5um, φ4.6mm×250mm)。

(2)流动相(A) 1％乙酸＋0.5％三乙胺溶液(pH= 4.5);

(B)A＋甲醇(50：50)。

梯度洗脱程序在0～10min内，流动相B由0增至80％，再维持15min。流量为1mL/min。

(3)检测器UVD (275nm)。

3．分析结果

样品溶于流动相A后进样，维生素K₃样品中应加入Na₂SO₃，以避免2-甲基萘醌的生成；维生素B₁₂和烟酸在一起时不稳定，应在测定时现用现配。

离子对试剂三乙胺的浓度对维生素B₁、维生素B₆、烟酸和维生素K₃的分离影响很大，应选用最佳浓度。

水溶性维生素也可在反相键合相柱(C₈)或氨基键合相柱(u-Bondapak-NH₂)实现分离。

二、在C₄烷基反相键合相上，多肽和蛋白质的分离

1．方法原理

YMC-Pack Protein-RP是在硅胶上键合短的C₄烷基链的反相固定相，特别适用于长链多肽和蛋白质的分析。

图9-73  为多肽和蛋白质的分离谱图。

图9-73  在C₄烷基反相固定相上，多肽和蛋白质的分离
1-甲硫氨酸-脑啡肽；2-亮氨酸-脑啡肽；3-催产素；4-血管舒缓激肽；
5-血管紧张素I；6-核糖核酸酶A; 7-a-交配因子；8-胰岛素(牛)；
9-细胞色素c; 10-溶菌酶；11-牛血清白蛋白；
12-β-乳球蛋白；13-卵清蛋白

2．色谙分析条件

(1)色谱柱：φ4.6mm×25cm, YMC-Pack Protein-RP(5um,30nm)，室温。

(2)流动相：A:H₂O/三氟乙酸(100/0.1)。

B：乙腈/0.1％三氟乙酸溶液。

梯度洗脱：60min，线性梯度B由10％→90％，流速1.0mL/min。

(3)检测器：UVD(220nm)。

3．分析结果

用归一化法进行定量分析。