3．改善色谱分离选择性的方法

(1)调节流动相的极性在高效液相色谱分析中，为使溶质获得良好的分离，通常希望溶质的容量因子k保持在1～10范围内，若溶质的k值大于10，或小于1时，可通过调节流动相的极性，来获取适用的k值。由于正己烷和水皆为非选择性溶剂强度调节溶剂，如若改变流动相的极性，必须加入具有选择性溶剂强度调节功能的适用溶剂。

①正相键合相色谱调节流动相极性的方法同样也适用于使用极性吸附剂的液固色谱和正相液液色谱，在此情况下，固定相的极性(P_s)大于流动相的极性(P_m)。若流动相的极性为^Pm₁时，溶质x的k_x>10，可增加流动相的极性，使^Pm₂>^Pm₁，则可使溶质x的k_x值重新位于1～10之间。若流动相的极性为^Pm₁时，溶质y的k_y<l，则可减少流动相的极性，使^Pm₃<^Pm₁，这样也可使溶质y的k_y值重新位于1～10之间，如图9-45 (a)所示。

图9-45  通过调节流动相的极性来改善分离的选择性

②反相键合相色谱调节流动相极性的方法同样也适用于使用非极性吸附剂的液固色谱和反相液液色谱，此时固定相的极性(P_s)小于流动相的极性(P_m)。若流动相的极性为^Pm₁，溶质x的k_x>10,此时可降低流动相的极性至^Pm₂，使^Pm₂<^Pm₁，就可调节溶质x的k_x值，使其重新位于1～10之间。若当流动相的极性为^Pm₁,时，溶质y的k_y<1,就可增大流动相的极性至^Pm₃，使^Pm₃>^Pm₁，也可调节溶质y的k_y,使其重新位于1～10之间，如图9-45 (b)所示。此时应当注意，在反相色谱分析中，当流动相的极性减小时，会增强对溶质的洗脱强度，使溶质的k值减小；当流动相极性增大时，会减小对溶质的洗脱强度，使溶质的k值增大。

当溶剂或混合溶剂组成的流动相的极性参数P'发生变化时，溶质的k值也随之变化，经试验表明，当流动相的P'值改变2时，溶质的k值约变化10倍。

(2)向流动相中加入改性剂向流动相中加入改性剂主要有两种方法。

①离子抑制法在反相色谱中常向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液，以使流动相的pH值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性。例如在分析有机弱酸时，常向甲醇-水流动相中加入1％的甲酸(或乙酸、三氯乙酸、H₃PO₄、H₂SO₄)，就可抑制溶质的离子化，获得对称的色谱峰。对于弱碱性样品，向流动相中加入1％的三乙胺，也可达到相同的效果。

②离子强度调节法在反相色谱中，在分析易离解的碱性有机物时，随流动相pH值的增加，键合相表面残存的硅羟基与碱的阴离子的亲和能力增强，会引起峰形拖尾并于扰分离，此时若向流动相中加入0.1％～1％的乙酸盐或硫酸盐、硼酸盐，就可利用盐效应减弱残存硅经基的干扰作用，抑制峰形拖尾并改善分离效果。但应注意经常使用磷酸盐或卤化物会引起硅烷化固定相的降解。

显然，向含水流动相中加入无机盐后，会使流动相的表面张力增大，对非离子型溶质，会引起k'值增加，对离子型溶质，会随盐效应的增加，引起k'值的减小。

4．溶质保留值随溶剂极性变化的一般保留规律

前述使用极性吸附剂的液固色谱、正相液液分配色谱、正相键合相色谱皆可称为正相色谱。使用非极性吸附剂的液固色谱、反相液液分配色谱、反相键合相色谱皆可称为反相色谱。

图9-47表达了作为极性函数的样品和溶剂，在正相色谱和反相色谱中，选择不同极性溶剂作流动相时，引起不同极性溶质(A>B)的保留值变化的一般规律。

图9-47  溶质保留值随它和溶剂极性变化的一般保留规律

在正相色谱(图9-47上半部)中，使用弱极性溶剂作流动相，则极性弱的B组分先流出，A组分后流出。当更换中等极性溶剂作流动相时，二者流出顺序不变，但它们的保留值都进一步减小。

在反相色谱(图9-47下半部)中，使用中等极性溶剂作流动相，则极性强的A组分先流出，B组分后流出；当更换强极性溶剂作流动相时，二者流出顺序不变，但它们的保留值会进一步增大。