根据真核生物进化的内共生学说：线粒体和叶绿体最初为自主生物，被原始真核生物吞噬后在漫长的进化过程中由寄生变为了共生。在这漫长的进化过程中，叶绿体和线粒体中的大部分基因逐步转移到了核基因组中，不同物种的核基因组中有20000～45000个基因，而线粒体基因组和质体基因组共含有大约200个基因。与核基因组、线粒体基因组相比，质体基因组的基因密度是最大的，在120～210kb的基因组中含有100多个基因。其中的基因可以大体分为三大类：①编码遗传信息的基因，rRNA, tRNA、核糖体蛋白基因，以及真核类型的RNA聚合酶的核心酶亚基；②与光合作用有关的基因；③一些其他的基因和开放阅读框。随着测序技术的飞速发展，目前包括烟草(彩图3)、水稻、玉米和小麦等在内的200多个物种的质体基因组都已经测序完成。

叶绿体是植物中的重要细胞器，不仅是光合作用的场所，也参与了氨基酸、核酸、脂肪酸和淀粉等许多物质的生物合成过程。随着对叶绿体基因组研究的不断深入，通过同源重组将外源基因定向导入叶绿体基因组并实现表达已成为可能。自从1990年高等植物烟草的叶绿体转基因技术获得成功后，叶绿体转化的优势已逐渐被人们认识并应用：①转化手段简便易行，蛋白质可高效表达，且表达的药用蛋白纯度高，无需贵重的色谱纯化手段；②导入的外源基因稳定性高，原核基因无需修饰改造就能直接表达；③可以避免基因的位置效应和基因沉默；④由于叶绿体的母系遗传特性，纯系的种子后代将永远保持纯系，不会因为有性杂交而发生分离，同时外源基因也不会随花粉扩散而造成环境安全性问题。因此，其具有独特的优越性和广阔的应用前景。

通常而言，可以根据不同的实验目的和需求设计相应的转化载体。与普遍采用的细胞核转化系统一样，叶绿体转化也可以分为瞬时表达载体和稳定表达载体。用于瞬时表达的质粒能让外源基因在植物质体中表达，但外源DNA并未整合到质体基因组上。到目前为止，仅有少数几篇文章报道了标记蛋白GFP或GUS在质体中的瞬时表达。但该系统的主要问题是基因枪法及显微注射法后如何检测基因是否是在质体中表达以及表达定量问题。因此，一种广泛适用的、可靠的、易于操作并可定量的瞬时表达转化系统仍有待开发。

目前质体稳定转化多采用基因枪等方法，通过同源重组的方式使外源基因整合到质体基因组中。在下面的内容中将介绍基于同源重组原理的质体稳定转化载体的结构(图9-6)和功能。

图9-6质体转化载体结构示意图

一、转化载体的结构

质体转化的机制是，利用转化载体两侧带有的质体基因组的同源序列，经过两次同源重组事件将外源DNA整合到质体基因组中。两边的同源序列大小一般多为1kb左右，这样一方面可以保证重组的效率，另一方面可以降低构建大型质粒面临的技术困难。

由于同源重组机制，外源基因可以定点插入到目标位点。在选取外源基因插入的整合靶位时，为了避免改变基因组内源基因的表达，多选用基因间的非编码区，尤其是转移RNA(tRNA)之间。叶绿体基因组测序结果就提供了有利条件，目前已有至少14个基因间区域被选用，常用的有：trnV和3'rps12间、trnG和trn fm间以及trn1和trnA间的序列。

二、表达调控元件

质体转化载体中的表达盒(expression cassette)需要多个符合质体基因表达机理的表达元件：启动子、5'UTRs、核糖体结合位点和3'UTRs终止区等。启动子、5'UTRs和核糖体结合位点可以合称为5'调控区。为了实现转基因的高效表达，就需要质体特异的启动子以及来源于质体或噬菌体的翻译调控区(5'UTRs和核糖体结合位点)。

(一)NEP型和PEP型启动子调控元件

质体基因组并不大，但在转录水平上却受两种不同类型的RNA聚合酶调控：质体编码的RNA聚合酶(plastid-encoded RNA polymerase, PEP)以及核基因编码的噬菌体类型聚合酶(nuclear-encoded RNA polymerase, NEP)。在双子叶植物和单子叶植物中含有不止一个RpoT基因。单子叶植物(作物类)有两个RpoT基因，一个编码线粒体的RNA聚合酶(RpoTm)，另一个编码质体RNA聚合酶(RpoTp)。双子叶植物中有3个RpoT基因，第一个编码线粒体的RNA聚合酶(RpoTm)，第二个编码质体RNA聚合酶(RpoTp)，第三个通过GFP融合定位试验表明是双向定位的，既定位在线粒体中，也定位在质体中(RpoTmp)。在单子叶植物中，RpoTp mRNAs的表达量在发育初期的细胞中特别丰富，这和在叶绿体发育初期NEP酶活性对带有PEP启动子的基因的转录是非常重要的这一理论是完全符合的。

叶绿体基因rpoA, rpoB, rpoC1和rpoC2与大肠杆菌相应RNA聚合酶基因同源，分别编码叶绿体RNA聚合酶的α、β,β'和β”亚基，不过PEP聚合酶中σ酶启动子识别所需的δ因子却是由核基因编码的。在单细胞的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti)中仅有一个核基因编码。因子，在高等植物中则进化为一个基因家族，特异基因调控PEP的特异转录。而NEP是核编码的针对线粒体和质体不同异构体的仅含有单个亚基的噬菌体类型聚合酶。在这种双转录体系中，质体基因转录的机制极为复杂，质体基因和操纵子多含有多个启动子，并可以分为三种类型：NEP识别的启动子、PEP识别的启动子以及被两种聚合酶都识别的启动子。质体基因的突变体研究数据表明，在成熟叶绿体中PEP启动子主要调控光合作用基因的转录；编码看家功能(尤其是在转录和翻译作用上)蛋白质的基因多由PEP和NEP聚合酶转录，只有少数看家基因只具有NEP启动子。有意思的是编码三个PEP型RNA聚合酶亚基的rpoBrrpoC1-rpoC2顺反子也仅带有NEP识别的启动子，这就意味着PEP的活性和丰度是依赖于核编码的RNA聚合酶的，从而表明质体的发育是受核基因调控的。

质体基因的多数启动子是被细菌类型的RNA聚合酶(PEP)识别的，所以它们带有一系列典型的σ ⁷⁰型启动子的-35 (TTGaca)和-10 (TAtaaT)保守序列。对编码光合系统Ⅱ反应体系中的Dl蛋白psbA的启动子研究已非常深入。细胞内试验表明psbA的转录是受质体发育和光照调控的。通过对芥菜(mustard)的psbA启动子分析表明，在-35和-10区域间还有一个TATATA启动元件，该元件和被二型RNA聚合酶转录的核基因的启动子中的TATA元件相似。该元件和-10元件盒对基因在光照条件和黑暗条件下的表达是必需的,-35元件盒则是提高光照条件下转录水平的必备元件。在大麦中，该TATA结构也是在-35和-10区间之间，但-35元件区对基因表达是必需的。在小麦中psbA启动子也具有该TATA结构域，但该元件对转录并没有起很大作用。在叶片基部psbA的转录需要-10和-35元件区，在叶片尖端psbA转录则只需要-10元件区和在-10元件区上游的(TG)_n结构。

经研究表明尽管rrn16启动子的序列是非常保守的，但是即使在相近的种间启动子的使用也是多变的(图9-7)。在烟草、大麦、玉米和豌豆中rrnI 6启动子是典型的σ70类型的PEP启动子(PI)；但在烟草中rrn16的启动子中还有一个NEP启动子(P2)，这个元件在叶绿体中无活性，但是在BY2组织培养细胞中和无PEP聚合酶活性的突变体中就具有功能。在菠菜中rrn16的转录起始点在P1启动序列之间(命名为PC位点)，研究表明尽管菠菜具有完整的P1启动子，但不具有识别p1位点的起始蛋白。在不同的物种或组织中，相同基因或操纵子的启动子也有很大不同，也有报道表明，环境作用和质体的发育也能够引起由于不同的核编码的。因子的利用而发生启动子类型的改变。另外，对PEP缺失的烟草质体和玉米中的质体RNA聚合酶活性的研究表明，除了不同组织间和质体类型间启动子的选择性利用外，在质体中mRNA的利用率在决定转录的效率上也具有明显的作用。目前，具有高效转录能力组成型σ⁷⁰型16S rRNA操纵子的启动子(Prrn )以及光调控的psbA启动子是质体转化表达载体中应用最多的启动子。

图9-7菠菜、拟南芥、烟草和大麦的。16启动子结构示意图

由于质体基因表达是基因转录后水平的调控，所以为了保证蛋白质表达的效率，保障翻译的5' UTRs和核糖体结合位点就显得尤为重要。例如，噬菌体T7基因10表达序列(T7g10)和人工合成的18bp包含核糖体结合位点的rbcL 5'UTR。

目前可用的组合为数不多，现在能够保证高的转录水平和翻译效率的最好的实例是：强的组成型σ⁷⁰型16S rRNA操纵子的启动子(Prrn )和噬菌体T7基因10表达序列(T7g10)的组合。

(二)诱导型启动子的应用

利用组成型(constitutive)强启动子尽管可以实现目的蛋白的高效表达，但也存在着一些弊端：表达外源基因可能会对植物的生长和发育带来代谢负担，尤其是由于质体转化系统能够保证外源蛋白高效表达。已有研究表明，某些蛋白质的组成型高效表达会对植物造成明显的负面效应，发生明显的代谢产物改变，甚至是表型发生改变。为了让目的蛋白在特定的时期表达，就需要特异的诱导启动子。利用诱导型启动子通过特定的化学或物理处理方式，不仅可以解决以上弊端，同时在指定的时间起始或关闭特定基因的表达，对基础研究也将具有极大的应用价值。

质体基因表达是通过启动子针对生理、发育或组织特异参数来调控转录水平的，所以在质体中诱导表达必须要利用质体内源的调控元件。第一个报道的在质体中的成功诱导系统是一个双重系统：质体转基因在噬菌体T7启动子的下游，同时T7聚合酶在核基因组中被乙醇诱导表达并通过前导肽导入到质体中，从而调控质体中整合的目的基因的转录起始。但这个系统仍存在一些缺点，因为T7启动子也可以被质体RNA聚合酶识别，所以在未诱导状态下已经有背景表达了，这种背景的低量表达也会引起植物发生表型改变。

2010年，Verheng报道了新的诱导系统，该研究组利用人工合成的核糖开关(ribo-switch)作为有效的翻译元件，在茶碱(theophylline)的诱导下，报道基因gfp大量表达，最重要的是在非诱导条件下，gfp没有背景表达。这一体系作为一个新的质体基因诱导系统可以严格调控基因的诱导表达，有着广阔的利用价值。

(三)3' UTR(非编码区)

3' UTR(非编码区)多包括一个符合稳定转录子需要的茎环结构(Monde et al. ,2000)。不同于真核基因组或是细菌中的3' UTR，大多数3' UTR并不具有终止转录的功能，更多的是作为转录加工识别位点和起稳定转录子的作用。尽管运用不同的3' UTRs会使基因有不同的转录水平，但是由于质体基因表达是转录后调控水平上的，所以在蛋白质表达水平上没有明显不同。因此可以认为3' UTRs与启动子及5' UTR比较而言并不是那么的重要。目前多采用的终止子是来源于rbcL基因的终止子(T rbcL) , psbA基因的终止子(T psbA) ,rpsl6基因终止子(Trps16 )和来源于细菌的rrnB基因的终止子(T rrnB )。在利用了内源的表达元件后，不可避免地增加了其和质体基因组中的内源表达元件同源重组的可能性，所以在设计和选用表达元件时，应在保证其功能最大化的前提下，注意寻找最小序列元件，同时也可选用非本物种来源的表达元件。

(四)多基因表达元件

随着现代生物科技的发展，调控复杂的代谢途径和改变复杂的农艺性状，单个基因的表达已经无法满足实际需要。叶绿体基因多为多顺反子转录单位，在叶绿体基因组中，一个操纵子里的多个内源基因可同时转录和翻译，从而使多基因的表达在一次转化中形成整条代谢途径成为可能，这也是叶绿体转基因技术的显著优势之一。在目前可选择的有效表达元件不多的情况下，利用质体基因组多顺反子操纵子(多个基因在一个操纵子里，由一个启动子起始转录)就提供了一个新的途径。例如，通过一个50bp的序列[命名为多顺反子间基因表达元件(intercistronic expression element, TEE)]可以介导多顺反子中基因的mRNA加工，形成稳定的单顺反转录子。这一个仅有50bp大小的TEE元件为叶绿体转化技术的多基因表达提供了一个新的工具，被应用于新的转化载体中(图9-8)。多个基因通过一个操纵子表达不仅可以通过一次转化直接实现，而且由于单启动子就可以表达多个基因，避免了启动子的重复使用引发的非目的性的同源重组而产生的基因组改变，同时也将大大简化转化载体的构建。利用这一个TEE表达元件将降低多顺反子加工后由于基因不稳定而无法翻译的可能性，从而增加叶绿体中基因表达的成功率，并可应用于报道基因和筛选基因的共表达、对复杂生化途径的调控、植物的多效抗病性和生物医药的制造，从而在更大程度上推动叶绿体转化技术的广泛运用。

图9-8多基因表达转化载体结构示意图