植物病毒对植物细胞的侵染过程实际上是自然界一种自发的基因转移过程，其侵染寄主细胞的过程与农杆菌Ti质粒相似，所以其本身就是一种潜在的基因转化系统。到目前为止，病毒载体主要用于基因的功能研究，还没有实验证明可以利用病毒载体来进行植物转化获得转基因的后代。目前正在研究发展作为植物基因工程载体的病毒主要有三种不同类型，即单链RNA植物病毒、单链DNA植物病毒和双链DNA植物病毒(图9-5)。

一、双链DNA病毒转化载体

在植物病毒中只有两组双链DNA病毒，花叶病毒(caulimovirus)和黄瓜脉黄化病毒(cucumber vein yello-
ZVing virus)。

图9-5病毒转化载体分类

花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)是花叶病毒中最具有代表性的一种。有关它的基因组结构、分子特性及功能都有较深入的研究。从外观上，该病毒为直径约5 nm的球形颗粒，DNA分子是双链环状分子，基因组大小约8kb。CaMV的35S启动子由于具有高强度的表达能力，已在大量单子叶和双子叶转化系统中普遍使用。由此可见，尽管CaMV是一种潜在的转化载体，但由于感染范围窄，接受外源DNA的容量有限(一般不超过250bp)，要广泛应用还有一段很长的路要走。

二、单链RNA病毒转化载体

单链RNA病毒占植物病毒总数的绝大部分，它们的寄主范围很不一样，有的很广，有的较窄，有的仅能感染双子叶植物，有的则仅能感染单子叶植物，也有的能感染两者。RNA病毒在寄主细胞中的复制和表达效率极高，以TMV为例，每个细胞中的病毒可以达到10⁶～10⁷个。TMV最早被用于构建抗原展示载体，曾成功表达了流感病毒血凝素、艾滋病毒抗原蛋白(HIV-Igp120)和疟疾抗原蛋白等。但研究表明，TMV衣壳蛋白仅能融合小于23个氨基酸的小肽，否则其组装会受到影响，且重组病毒生长速率比野生型慢。这些特性也限制了它的广泛应用。

三、单链DNA病毒转化载体

小麦矮化病毒是一种广范侵染单子叶植物的单链DNA病毒。它的基因组大小为2749bp，为环形单链DNA分子。根据序列推断其有5个开放阅读框结构，可以编码29.4kDa的衣壳蛋白，另外的30.1kDa和17kDa的蛋白质与基因组复制有关。目前多用不同的外来基因代替衣壳蛋白基因，如与衣壳蛋白基因大小相似的新霉素磷酸转移酶基因(npt Ⅱ)和氯霉素乙酰转移酶基因(cat)，也有报道可以表达3kb的半乳糖苷酶基因。

四、病毒转化载体的构建

病毒转化载体根据其构建类型可以分为置换型载体、插入型载体、基因互补型载体及抗原展示型载体4种。下面逐一做简单的介绍。

置换型载体(gene replacement vector)：用外源基因置换病毒基因组中的外壳蛋白等非必需基因，保留与病毒侵染及复制有关的基因，达到高效表达外源基因的目的。但这类载体仍存在一定的缺点：以外源基因替代病毒本身的基因可能会打破病毒本身的基因平衡系统，造成病毒整体基因组的紊乱，引起病毒不能在宿主体内系统运动或外源基因表达水平低等不利结果。插入的外源基因较小，容易发生重组而丢失外源基因，寄主范围有限。

插入型载体(gene insertion vector)：指将外源基因插入到病毒本身的启动子下游，或者将带有外源启动子的目的基因插入到病毒载体基因下游，使外源基因随病毒的增殖而表达。外源基因插入的位点通常选择在病毒的CP基因启动子位点之后。球状及二十面体等轴对称病毒，由于包装的限制不能插入较大的外源基因。而杆状和丝状植物病毒因包装限制较小，已知至少可容纳1.8kb的外源基因。PVX病毒的寄主范围广、复制水平高、外源基因可以高效稳定表达、无昆虫传播媒介等优点使其成为重要的插入型载体。在构建载体时，为了克服载体中由双CP亚基因组启动子序列而引发的高频重组，现在多采用病毒亲缘关系较近的亚基因组启动子启动外源基因表达，或利用密码兼并性的特点替换基因重复的序列。

基因互补载体是指把外源基因插入到有功能缺陷型病毒组分或亚病毒组分内，通过感染转基因植物或辅助病毒共侵染宿主来互补功能的缺陷。为了降低重组发生的频率，可采用两种交替突变的病毒，其中一个携带外源基因，一个作为辅助病毒共侵染宿主，两种病毒可同时存在于宿主体内，并可以克服对外源基因的大小限制。

抗原展示型载体是指在病毒的CP基因内选择性插入外源基因，在不影响病毒本身复制、包装、侵染的情况下将外源蛋白多肽呈现在病毒粒子的表面。这样通过提纯重组病毒粒子即可获得大量抗原，并且这种方法可以大大增加一些小分子质量抗原的免疫原性，从而更易被哺乳动物的免疫系统识别，因此对获得一些免疫原性较差的致病菌抗原蛋白具有重要的意义。但是这种载体也受外源基因大小的限制。例如，TMV抗原展示型载体系统仅能融合表达小于23个氨基酸的小肽，否则就会影响病毒的组装，甚至减慢病毒的生长速率。这种缺点限制了抗原展示型载体的广泛应用，但以植物作为生物反应器用来合成疫苗或药物，仍是今后研究的主要方向。