尽管Ti质粒和Ri质粒是植物基因工程的一种天然载体，但在真正的实践应用中则存在如下障碍：①质粒分子质量过大，在基因工程中难以操作；②质粒上分布着各种限制性内切核酸酶的多个切点，难以找到可利用的单一限制性内切核酸酶位点，因而不能通过体外DNA重组技术直接向野生型质粒导入外源基因；③T-DNA区内含有许多编码基因，其中致癌基因(onc)的产物会干扰宿主植物中内源激素的平衡，阻碍细胞的分化和植株的再生；④野生Ti和Ri质粒不能在大肠杆菌中复制，只能在农杆菌中进行扩增，但农杆菌的接合转化率只在10％左右，所以在常规分子克隆条件下无法实现；⑤质粒上还存在一些对T-DNA转移不起任何作用的基因。鉴于上述原因，我们必须对其做相应的改造(如去除onc基因等)才有可能在植物基因工程中广泛使用。下面以Ti质粒载体的构建为例来介绍农杆菌质粒载体的构建。

Ti质粒载体可根据是否携带用于双交换(double crossing-over)的同源重组序列而分为两种类型，一种类型为无同源序列的随机整合载体；另一种类型为同源序列重组后通过正选择或是负选择标记基因而进行定点整合的基因打靶载体。目前在植物核基因组中利用同源重组来进行的基因打靶效率极低，还有待进一步的深入研究。并且由于Ti质粒载体是利用非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEL)的整合机制，所以在这里主要介绍无同源序列的随机整合载体。

用于随机整合的Ti质粒载体构建过程主要包括中间载体(intermediate vector)构建、中间表达载体(intermediate expression vector)构建和供体一受体质粒的构建。

(一)中间载体

中间载体一般是将去除了onc基因的T-DNA片段克隆到多拷贝的大肠杆菌的质粒中，构建成卸甲载体(disarmed vector)。这样可以解决在体外操作中农杆菌不能直接导入目的基因的困难。中间载体需要具有以下特征：①具有一个或几个细菌选择标记，利于筛选共整合质粒；②含有植物选择标记，以利于植物转化细胞的筛选；③含有多克隆位点(MCS)，以利于外源基因的插入；④具有bom位点，在有诱导质粒存在的情况下，可以使中间载体在不同细菌细胞间进行转移。按照结构特点又将中间载体细分为两类：共整合系统中间载体(图9-3)和双元载体系统中间载体(图9-4)，它们之间的区别就在于共整合载体必须含有与受体Ti质粒T-DNA区同源的序列，保证其可以高频地与受体Ti质粒的T-DNA进行重组，可以无Ti质粒的边界序列；而在双元载体系统中的中间载体不要求系统中两质粒具同源序列，但需要具有LB和RB边界序列，且具有在农杆菌中自主复制的复制子。

图9-3共整合系统中间载体结构示意图

图9-4双元载体系统示意图

常用的受体Ti卸甲载体有pGV3850，由胭脂碱型pTiC58衍生而来；pGV2250是章鱼碱型pTiB6S3的衍生质粒，其包括Nos基因在内的整个T-DNA以及两侧的边界区均被pBR322的序列取代，所以彻底解除了武装，没有侵染能力和T-DNA转移能力。

(二)中间表达载体

带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体，将外源基因和植物表达元件(其中启动子和终止子负责转录水平的调控；5’端和3’端序列负责转录后调控；内含子的利用则可以提高基因表达水平；信号肽等)连接，构成嵌合基因(chimeric gene)，最终构建出适用于在受体细胞中表达外源基因的载体。

在这些表达元件中值得一提的是对启动子的选择和使用。植物基因工程中用到的启动子大致可以分为组成型表达启动子(constitutive promoter)、诱导型表达启动子(inducible promoter)和组织特异型表达启动子(tissue-specific promoter)这样三类。

目前在农杆菌转化中使用最多的组成型启动子是烟草花叶病毒(CaMV) 35S启动子，以及我们在前面提到的来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因(ocs)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)启动子。值得注意的是，根据最近研究表明nos启动子的强度依组织部位和器官位置不同而变化，新生组织比成熟组织内要弱，同时它在禾本科植物中没有启动表达能力或表达能力难以检测。可见，启动子的分类不是绝对的，随着研究的深入，会有新的发现和变化。
诱导型启动子是指一类在某些特定的物理或化学信号的刺激下启动表达的启动子。包括光诱导启动子(如核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因rbcS的启动子和叶绿素a/b结合蛋白基因cab的启动子)、热诱导启动子(如玉米和大豆热激蛋白基因Hsp的启动子)和损伤诱导启动子、乙烯等化学物质诱导启动子等。

组织特异性表达启动子也称为器官特异性启动子(organ-specific promoter)，即基因的表达多只发生在某些特定的器官或组织部位，如花粉特异表达基因启动子。

(三)供体一受体载体(donor-recipient vector)

由于直接利用野生Ti质粒做体外克隆很困难，Ti质粒功能表达载体含有Ti质粒Vir基因及切除onc基因的受体Ti质粒和含有启动子、终止子、选择标记、报告基因及T-DNA LB/RB的供体Ti质粒。在前面介绍中间载体时已经提到，当这两个Ti质粒载体被先后导入农杆菌时，根据它们之间是否含有同源序列可分为两种：共整合载体(图9-3)和双元载体(图9-4 )。

(1)共整合载体系统具有两个独立的质粒，农杆菌Ti质粒和大肠杆菌中间载体。中间载体与Ti质粒通过同源重组使外源基因整合到T-DNA区，共整合质粒在农杆菌中可以稳定存在(图9-3)。

(2)双元载体系统具有两个质粒，即穿梭质粒(即中间载体)和Ti质粒，这些质粒可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。从大肠杆菌转移到农杆菌的频率比共整和质粒的转移频率高10 000倍。在前面已经知道，T-DNA向植物基因组插入是T-DNA两端25bp的重复序列作用的结果。所以穿梭质粒具有1个或2个T-DNA边界重复序列，植物选择标记及用于外源基因克隆的多克隆位点。农杆菌质粒是经过改造的Ti质粒，具有Vir基因和农杆菌复制起始子，但没有T-DNA边界序列。两个质粒在选择压力下可以自主共存于同一个农杆菌中。当农杆菌感染受伤的植物时，Ti质粒上的Vir基因受植物的创伤信号启动，与穿梭质粒上的右边界序列发生反式相互作用，将穿梭质粒的T-DNA切割下来从而将T-DNA转移进入植物基因组(图9-4)。