植物的种子萌发、形态建成、植物个体的自我繁殖以及植物个体抵抗外界环境各种因素的侵害等过程都是基因的精密调控过程，在植物的整个生长过程中，有大量的基因参与表达，这些基因在表达时间和空间以及表达的丰度等方面各不相同。正是由于植物体中这些不同基因在时空上的表达变化存在，可以利用基因表达差异来分离各种不同的植物基因。

根据基因的表达变化克隆基因是基因克隆方法创新最为活跃的一个领域，从传统的cDNA文库扣除杂交到现在大规模对基因表达进行分析的DNA芯片方法，利用基因表达差异发展起来的基因克隆方法达到了数十种之多。下面我们就选取其中的差减杂交方法进行分析。

抑制差减杂交方法(suppression substraction hybridization, SSH)是由Diatchenko等建立的一种特异地分离与表达差异有关的EST序列的一种方法。这种方法利用不同样品之间基因表达的差异，分离有表达差异的EST，然后克隆基因。例如，某个基因A在样品1和样品2之间存在表达差异，如果A基因在样品1中的表达水平高于样品2(也就是mRNA的拷贝数在样品1中的表达水平高于样品2)，那么通过同源片段结合去掉样品2的拷贝数，多出来的拷贝数就是A基因的表达差异。SSH方法的基本流程可以分为6个步骤。

(1) cDNA的合成与限制性酶切。将两个不同的组织，或者同一个组织的两种不同表达状态下的细胞中的mRNA分子分别抽提出来，并将它们反转录为双链cDNA。双链cDNA利用限制性内切核酸酶RsaⅠ将这两种不同的cDNA分子酶切为EST片段。

(2)将待测试组织和对照组织的EST分别命名为测试cDNA (tester cDNA)和驱动cDNA (driver cDNA)。将测试cDNA分子分成相同的两个组分，并且分别与不同的引物接头(adaptorl, adaptor2)相连接。而驱动cDNA分子不与接头相连接。

(3)第一次杂交。将连有接头的两个测试组分的cDNA分别与过量的驱动cDNA杂交。通过第一次杂交以后，在杂交的组分之中就可以形成4种不同的cDNA分子，包括单链的tester cDNA、自身退火的双链tester/tester cDNA、异源的双链cDNA(即tester/driver cDNA)和driver cDNA双链分子。这些组分在两个带有不同接头的试管中有所不同。

(4)第二次杂交。取出第一次杂交中的部分组分合并以后再与过量的驱动cDNA杂交。这些杂交组分合并在一起以后，在上述的成分基础之上能够形成一种新的杂交成分，也就是分别含有不同接头的tester cDNA分子(tester-adaptorl1, tester-adaptor2)。

(5)特异性的片段扩增。这些含有不同引物的tester-adaptor1/tester-adaptor2的片段经过两次PCR扩增以后就能够获得特异性差异表达的EST序列。这些差异表达的EST与载体连接形成差异表达EST文库。对每一个差异表达的克隆进行测序分析，就可以获得样品之间的差异EST。这些差异表达EST经过定量验证它们确实在样品之间存在差异，这些EST就能够用于差异表达基因的克隆。

(6)差异表达EST的全长cDNA克隆。利用前文所述的RACE技术分离差异表达EST的全长cDNA。