1．酵母双杂交体系

酵母双杂交体系主要用于研究蛋白质之间的相互作用。该体系用于分析已知蛋白质之间的相互作用，或者是用于筛选与已知蛋白质相互作用的未知蛋白质分子。酵母双杂交系统的可行性和实用性经过多年的使用已经十分完善。

酵母双杂交的基本原理：真核细胞的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域(DNA binding domain, BD)和转录活化结构域(transcription activation domain, AD)共同完成的。这两个结构域通过共价或者非共价连接建立的空间联系是导致蛋白质之间相互结合和转录激活的关键。利用这个特点，我们就可以进行蛋白质相互作用之间的分析。

假定两个不同的蛋白质分子X和Y，它们之间存在相互作用。那么，我们可以将X和Y分别与酵母转录因子的两个结构域结合形成融合蛋白质，也就是BD-X/AD-Y或者BD-Y/AD -X。当这两个蛋白质结构域(BD-X/AD-Y)单独存在时无转录激活功能。而当两个不同的蛋白质分子X和Y之间存在相互作用、BD/AD两个结构域靠近或者共价结合时转录功能恢复。
在通常的情况下，已知的蛋白质X与DNA结合结构域相互融合形成BD-X融合蛋白，而待检测的蛋白质Y与转录活化结构域相互融合形成AD-Y,, X-BD融合蛋白称为诱饵蛋白(bait protein)，而Y-AD融合蛋白称为被诱捕蛋白(prey protein)。含有X, Y的蛋白质同时在一个酵母菌中表达，当X与Y之间能够发生相互作用时，诱饵蛋白和被诱捕蛋白之间能够在空间上相互靠近，报告基因得以激活。相反，如果X与Y之间没有相互作用，诱饵蛋白和被诱捕蛋白质之间就不能够在空间上相互靠近，报告基因不表达。根据这个原理可以方便地检测蛋白质之间的相互作用。

酵母双杂交系统充分利用了酵母能够表达真核生物基因，不需要分离纯化蛋白质，整个过程只需要对核酸进行操作，同时酵母的生长速度快、容易操作等优点，使酵母双杂交系统的应用十分广泛。

常用的酵母双杂交体系包括以GAL4为基础的体系和以LexA为基础的双杂交体系(图8-10)。

图8-10酵母双杂交示意图

A．转录激活示意图；B.酵母双杂交示意图。

AD表示转录激活位点；BD表示DNA结合位点；reporter gene为报告基因酵母双杂交系统使用的基本步骤如下所述。

(1)鉴别已知蛋白质之间是否存在相互作用。鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用是酵母双杂交系统最为有效的方法。只需要将两个待研究的蛋白质分别与AD和BD相互融合，同时转化同一个酵母菌，通过检测报告基因是否表达来判定X与Y之间是否存在相互作用。图8-11为如何检测两个蛋白质之间是否存在相互作用的流程图。

图8-11鉴别已知蛋白质之间有无相互作用的流程图

(2)寻找与某个蛋白质相互作用的未知蛋白质。研究蛋白质之间的相互作用可以鉴定出与已知蛋白质发生作用的新的蛋白质分子。寻找与目的蛋白质相互作用的蛋白质时，首先构建含有目的蛋白质基因的酵母菌表达质粒(BD-X)，鉴定BD表达质粒的自转录活性。如果蛋白质X没有自转录活性，那么BD-X就可以用于酵母双杂交的筛选。

然后，将待分析的cDNA克隆到AD表达质粒中构建酵母双杂交的cDNA文库(AD-cDNA)，将表达的质粒和杂交的文库共同转化酵母菌，获得表达的阳性克隆。抽提AD表达质粒并对阳性质粒的插入片段进行测序。测序完成以后，逐一分析所得到的候选蛋白与Y蛋白之间作用的真实性。如果确实存在相互作用，那么就可以初步认定两个蛋白质之间为互作蛋白。结合分子生物学和遗传学的手段，我们可以最后找到蛋白质X的互作蛋白。这个分析过程如图8-12所示。

2．噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是G. P. Smith等于1985年提出来的一种利用蛋白质相互作用的体外免疫系统，它能够将基因片段与蛋白质分子有效地联系在一起。噬菌体展示技术的基本原理是，当外源DNA片段分子插入到丝状噬菌体基因组中的一个外被蛋白质基因中时，如果两者的读码框架保持一致时，外源片段的DNA分子所编码的产物可以与外包被蛋白质一起形成一个融合蛋白质，这个融合蛋白质可以显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物的抗体，通过抗原一抗体的亲和作用，就能够从大量噬菌体中分离出含有所要基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增就可以得到大量所要的目的基因片段。

图8-12寻找与某个已知蛋白质相互作用的蛋白质

噬菌体展示技术的基本过程如下所述。

(1)构建噬菌体抗体库。构建一个大容量的噬菌体库是噬菌体展示技术的关键所在。通常用于构建噬菌体抗体库的噬菌体包括两种不同的类型。一种是以M13, fl, fd等为载体的抗体库；另一种是以上述噬菌体的复制起始序列为基础组建的噬菌体质粒载体(Phagemid)。

丝状噬菌体的外被蛋白基因班和基因珊是常用的与外源DNA序列一起产生融合蛋白的基因。基因Ⅲ编码由406个氨基酸组成的P3蛋白，每个噬菌体由3～5个不同P3蛋白组成，位于丝状噬菌体的一端。基因Ⅷ编码50个氨基酸组成的P8蛋白，每个噬菌体上大约有2700个P8蛋白质分子。这两种不同蛋白质的共同点是蛋白质的N端位于噬菌体的外部，而C端位于噬菌体的内部。当外源DNA片段与这两个基因相互融合时蛋白质的片段暴露在噬菌体的表面。

对实际使用而言，研究者更偏向使用噬菌体质粒载体作为构建抗体库的载体，由于噬菌体质粒载体既有质粒的复制起点又有噬菌体的复制起点，十分容易操作并且转化效率比较高。

抗体库的构建：首先利用限制性内切核酸酶将噬菌体质粒载体酶切，然后与待分析组织的cDNA分子进行连接，连接以后的DNA分子直接转化大肠杆菌宿主细胞，转化以后的大肠杆菌在帮助噬菌体(helper phage)的作用下，噬菌体质粒被包装，然后通过噬菌体的获救方法构建成为噬菌体抗体库。一个比较典型的噬菌体抗体库的容量通常在10⁹个以上。随着抗体库容量的增加，筛选到特异性抗体片段的可能性就越大。

(2)从噬菌体库中筛选特异抗体。噬菌体抗体库构建完成以后，下一步的工作就是从抗体库中筛选特异的抗体。抗体筛选的基本原则是亲和捕获。首先将抗原包被在固相物质的表面，如384孔的微孔板上，然后加入噬菌体抗体库与抗原进行温育。温育一段时间以后，将微孔板放入缓冲液中进行淘洗。经过淘洗以后，表面留下那些能够与目标抗原相结合的抗体噬菌体。

亲和捕获方法的筛选效率高，特异性比较强，能够从10⁹个以上克隆的抗体库中筛选获得一个特异性的目的基因。

(3)阳性抗体克隆的DNA序列分析。由于经过一次亲和捕获的噬菌体有多个，因此亲和捕获以后的噬菌体进行繁殖，再次感染大肠杆菌。这些再次感染的大肠杆菌又可以形成一个小型的富集的噬菌体抗体库。这个小型的噬菌体抗体库再次重复以上的筛选过程直到获得少量的克隆为止。

(4) DNA序列的分析和验证。将这些有高度亲和能力的噬菌体进行回收。通过质粒获救的方法就能够将外源的片段分离出来。通过测序就能够获得基因的全部序列。

(5)基因功能的鉴定。通过突变缺失方法进一步分析基因功能。

除了上述的一些基因克隆方法以外，随着基因组技术的发展，利用生物信息学手段来帮助和寻找新的基因是一种重要手段。由于越来越多基因组的全序列被测定，随着功能基因组研究和后功能基因组研究时代的到来，基因克隆与分离在技术上已经不存在大的障碍。一般来讲，基因克隆的策略可分为正向遗传学和反向遗传学两种不同途径。前者以克隆基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型的突变进行，也就是以序列为出发点的方法；后者则着眼于在基因组中的特定位置进行，如图位克隆方法。虽然在本书中对这些方法进行了逐一介绍，但在实际研究过程中根据研究的需要这些方法实际上是交叉使用的。