一、实验目的

了解食品中大肠菌群和大肠杆菌快速测定方法的原理，掌握采用PetrifilmTM测试片直接计数法同时测鲜牛奶中大肠菌群和大肠杆菌数的操作方法。

二、实验原理

PetrinlmTM大肠杆菌／大肠菌群测试纸片(PetrifilmTME.coli／coliformcountplate)是一种预先制备好的培养基系统，含有结晶紫中性红胆盐(violetredbile，VRB)培养基、冷水呵溶性凝胶和葡萄糖苷酶指示剂。由于绝大多数(约97％)大肠杆菌(Escherichiacoli)能产生--β葡萄糖苷酸酶与培养基中的指示剂反应，从而产生蓝色沉淀环，所以当培养结束后，蓝点带气泡的菌落，即为大肠杆菌，而红点带气泡和蓝点带气泡的菌落之和为大肠菌群数。

三、仪器与试材

1．仪器与器材

生化培养箱、超净工作台、pH计、吸管、试管、放大镜或PetrifilmTM自动判读仪等。

2．测试片与溶液

PetrifilmTM大肠菌群测试纸片和压板、：NaOH溶液(1mol／L)、HCl溶液(1mol／L)、无菌生理盐水。

3．实验材料

3～4种不同品牌的鲜牛奶，各250mL。

四、实验步骤

1．检验流程

2．样品制备

(1)取100mL鲜牛奶，以NaOH或HCl溶液调节样品pH至7．2。

(2)取25mL样品，放于盛有225mL无菌生理盐水的锥形瓶中(瓶内预置适量的玻璃珠)，充分摇匀后，配制成1：10的稀释液。

(3)用1mL无菌吸管吸取1：10的样品稀释液1mL，沿试管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，制成1r：1[)(]的稀释液。

(4)另外，取1mL无菌吸管，按相同操作，制成1：1000的稀释液。如此稀释至1：10。的样品稀释液。每递增稀释一次必须换一支无菌吸管。

3．涂布测试片

(1)根据鲜牛奶的卫生标准要求GB19301—2003或对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品稀释液。

(2)在超净工作台上，揭开测试片上层膜，用无菌吸管吸取1mL稀释液，垂直滴加在测试片的中央处，然后将上层膜轻轻落下(注意不要滚动上层膜)。

(3)将压板(凹面底朝下)放置于上层膜之上，轻轻地压下，使样液均匀分布在测试片上。

(4)拿起压板后，静置至少lmin，以使培养基凝固。

4．培养

将测试片的透明面朝上水平置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，于(36±1)℃培养(48±2)h后，取出测试片立即计数。

5．计数与结果报告

(1)可采用目视、放大镜或Petrifilm自动判读仪来计数或判读实验结果。

(2)蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌。蓝色有气泡和红色有气泡的菌落数之和为大肠菌群数。

(3)培养片圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当出现大量气泡、不明显小菌落，培养区呈蓝点暗红时，需进一步稀释样品，以获得准确读数。

(4)选取目标菌落数在15～150之间的测试片，计数菌落数，乘以相对应的稀释倍数

报告。

(5)如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，则计数最低稀释度的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告。

(6)如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

(7)如果最高稀释度的菌落数大于150个，则计数最高稀释度的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告。当计数菌落数大于150个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20即为测试片上估算的菌落数。

(8)结果报告单位以cfu／mL表示。

五、注意事项

涂布PetrifilmTM测试片时，应确保测试片水平置于超净工作台面上，样液应垂直滴加在测试片的中央处，并避免上层覆盖膜直接落下，产生气泡。