抗血栓药物包括抗凝血药物、抗血小板药物、溶血栓药物及改善血液流变学的药物。当今血栓性疾病日益威胁着人类健康，抗血栓药物在血栓性疾病的预防和治疗中发挥着重大的作用，因此，研发高效低毒的抗血栓药物是当今的热点问题。抗血栓药物的活性及抗栓机制是研发抗血栓药物必须解决的实验关键问题。这其中涉及受试药物对凝血系统的影响、对血小板功能的影响及培养的血管内皮细胞分泌某些活性物质的检测等。但血小板在体外存活时间短，受洗涤、温度等条件的影响大，实验中应尽量保持血小板活性的一致性；某些活性物质的稳定性差，实验时亦应尽量缩短操作时间，稳定实验条件，保持分子的活性。在体外研究抗血栓药物对培养细胞的影响，对于揭示药物作用的特点及作用机制，进行药物监测，避免不良反应，指导临床用药等，具有重大意义。本节主要介绍抗血栓药物对血小板功能的影响及对培养的血管内皮细胞分泌的某些活性物质的检测等的实验方法。

一、抗血栓药物对培养的血管内皮细胞EDRF/NOS活性影响的试验

【原理和目的】

体外培养血管内皮细胞时，在具备一氧化氮合酶(NOS )所需辅助因子的条件下，可以L-精氨酸为底物合成一氧化氮（NO),L-精氨酸可转化为L-瓜氨酸，用¹⁴C标记的L-精氨酸转化为¹⁴C-L-瓜氨酸的量，即代表NOS催化合成NO的活性。

【材料】

1．体外培养的血管内皮细胞

2．培养基中加L-精氨酸0.48mmol/L, L-谷氨酸2mmol/L，丙酮酸钠1mmol/L, HEPES 1 mmol/L,10％小牛血清3.酶标仪

【方法】

1．血管内皮细胞体外培养与处理用生长良好的细胞汇合对数生长期的血管内皮细胞，实验前更换不含L一精氨酸的培养液，30分钟后加入14C-L-精氨酸（终浓度为850nmol/L,0.05 uCi/ml) ,1分钟后加入受试药物，于37℃孵育15分钟，以PBS洗涤细胞，用冰冷的HEPES-EDTA缓冲液（20mmo1/L,pH 6.0）收获细胞，超声破碎细胞（10秒，共3次），然后离心（15 000r/min，15分钟，4℃）。

2. NO合酶活性的检测 将lml离心后的上清液通过Dowex50阴离子交换树脂，吸附多余的¹⁴C-L-精氨酸，用1 ml水洗脱，¹⁴C-L-瓜氨酸在流出液中，以液闪计数流出液的放射性，代表L-精氨酸转化为L-瓜氨酸的量，并按下式计算NOS的活性。洗脱液中的¹⁴C-L-瓜氨酸用薄板色谱法与标准品对比加以验证。

【结果与分析】

1．本试验按上式以NOS转化L-精氨酸为L-瓜氨酸的百分率作为其催化产生NO的量并用以评价其活性，是间接以酶底物的转化作为酶活性指标的方法。采用核素标记，以DMP为量化指标，较为敏感。

2．用此法可观察受试药物对血管内皮细胞EDRF/NOS活性的影响。

【注意事项】

1．本方法步骤多，且影响检测结果的因素较多，因此实验中，核素标记的量、加入的样本量等都必须准确，而且血管内皮细胞必须在生长良好的条件下才可用于检测。

2．经Dowex50阴离子交换树脂柱洗脱的¹⁴C-标记物是否为L-瓜氨酸，必须用标准品作薄板色谱验证。

3．用¹⁴C的标记物放射性虽小，但其半衰期很长，故必须严格遵守放射性物质的管理方 法进行处理，以免污染环境。