调节葡萄糖在肠道内的吸收情况可影响体内的葡萄糖代谢，因此也作为抗糖尿病药物作用的靶点之一，如研究发现小檗碱可抑制肠道内葡萄糖的吸收而发挥降糖作用。本实验采用体外犊牛小肠上皮细胞，探讨胰岛素或抗糖尿病药物对葡萄糖吸收的影响，为研究调节葡萄糖吸收的抗糖尿病药物提供研究方法。同时，还可测定细胞增殖率，结合葡萄糖吸收率作为肠道细胞生长发育及功能成熟指标，探讨胰岛素或药物对细胞生长发育的影响，对研究胃肠道营养发育也有重要意义。

【材料】

1．动物出生1日龄以内未吮乳的中国荷斯坦犊公牛。

2．试剂

（1）DMEM/F,2培养液；

(2) 0.4％锥虫蓝染液

(3)四甲基偶氮唑盐（MTT) ;

(4）二甲亚砜(DMSO )；

(5)胰岛素 以PBS将注射用胰岛素稀释至200 ug/ml作为母液，经0.22 um微孔滤膜过滤除菌后，-20℃密封冻存。使用时，以DMEM/F12培养液稀释至所需浓度。

(6)葡萄糖检测试剂盒；

(7)蛋白测定试剂盒；

3．仪器C0₂培养箱；酶标仪；紫外分光光度计。

【方法】

1．细胞分离和培养

(1)将出生1日龄以内未吮乳的中国荷斯坦犊公牛宰杀后放血，无菌条件下取十二指肠约10cm，迅速放入预热至37℃生理盐水中，按照Evans方法制取小肠细胞（如下各步骤）。

(2)剪开肠管后用Hanks液冲洗8～10次（50ml/次），然后将肠管剪碎至每块约20mm³大小，加入50m1胶原酶Ⅺ，剧烈振荡后吸管吹打，镜检到50％绒毛分离。

(3)溶液转入试管，静置1分钟，收取上清液。在原离心管中加入50ml DMEM/F12培养液，静置后收取上清液。重复一两次后，混合所有上清液。

(4) 1000r/min离心5分钟，沉淀重悬于50ml DMEM/FI2培养液。重复离心操作4～6次直到上清液变澄清。在沉淀中加入15% (v/v)新生小牛血清的DMEM/F12培养液，吹打均匀。

(5)倒置显微镜下观察细胞形态。锥虫蓝法进行细胞计数，存活的细胞活力大于85%时可进行细胞培养。将细胞按1x10⁵/ml接种于24孔板，在5％的co₂培养箱于37℃培养。上述各过程均在无菌环境中进行。

(6) 48小时后，更换为含不同浓度胰岛素或待测药物的DMEM/F12培养液，用无血清培养液作为对照，继续培养72小时后，测定细胞增殖率。

2．细胞增殖率的测定各组细胞更换培养液培养72小时后，弃去培养液，每孔加入200ul无血清的DMEM/F12及20Oul 0.05％的MTT，在37℃,5% C0₂培养4小时后，弃去培养基和MTT，每孔加入0.5 ml二甲亚砜，用酶标仪测定OD540。

3．葡萄糖吸收率的测定配制葡萄糖浓度为4mg/ml的生理盐水溶液，用其稀释胰岛素使浓度分别为0.01,0.1,1,10及50ug/ml，或稀释待测的抗糖尿病药物。各组细胞在含15％胎牛血清的DMEM/F12中培养48小时后，分别用各组药物孵育细胞30分钟，然后按葡萄糖测定试剂盒要求测葡萄糖含量，即葡萄糖剩余量，以此计算葡萄糖吸收量。

葡萄糖吸收量=总葡萄糖含量-剩余量

【结果与分析】

1．如加入不同浓度的胰岛素，则一般可看到如下结果：0.01 ug/ml的胰岛素的作用通常很小，与对照组一般无显著性差异。随着浓度增加(0.1 ug/ml、 1ug/m1,10 ug/ml)，胰岛素的促细胞增殖作用及促葡萄糖吸收的作用逐渐增强。但当胰岛素浓度达到50ug/ml的超生理浓度时，胰岛素反而抑制细胞增殖并抑制葡萄糖的细胞（图11-27)。

2．为更准确地评价葡萄糖吸收情况，宜同时测定每孔细胞的蛋白含量，校正细胞葡萄糖的吸收量，即用每100mg蛋白吸收的葡萄糖量（mg/100mg protein)来反映细胞对葡萄糖的吸收情况。

【注意事项】

1. MTT的原理是利用活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶将外源性MTT还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲亚砜(DMSO）能溶解细胞中的甲攒颗粒，溶解后所呈现的颜色深浅与细胞的数量和活力存在良好的线性关系，可间接反映活细胞的数量及细胞代谢的活跃程度，因此在每孔加入DMSO，应待细胞内的紫蓝色晶体完全溶解后再应用酶标仪测OD540。

2. MTT 对菌很敏感，因此MTT制备后应无菌，另外MIT有致癌性需注意。