糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一种常见病和多发病，它是由胰岛素绝对或相对不足而引起的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质代谢紊乱的综合征，临床上以慢性高血糖为主要特征。糖尿病可引起多种慢性并发症，其中微血管病变和大血管病变是糖尿病患者致残、致死的主要原因。微血管病变包括肾病、视网膜病变、神经病变等；大血管病变包括高血压、冠心病、周围血管病变、脑血管疾病等。目前我国糖尿病患者群位居世界第二，已成为我国面临的一个严重的公共卫生问题。
本节主要介绍常用于抗糖尿病药物研究中的离体细胞实验，对研究抗糖尿病药物的作用和机制以及新药筛选具有重要的意义。

一、葡萄糖转运实验

【原理和目的】

葡萄糖不能自由通过细胞膜的脂质双分子层结构，而需要葡萄糖转运载体的作用完成向细胞内的转运。胰岛素和某些降血糖药可激活葡萄糖转运载体，促进葡萄糖的转运，从而调节糖代谢。脂肪组织是胰岛素的重要靶器官之一，在胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病中起重要作用。脂肪细胞主要依靠葡萄糖转运子4( Glut4）转运葡萄糖。胰岛素与其受体结合后，可使胞质内的Glut4迅速转位至细胞膜，参与葡萄糖的转运，因此脂肪细胞对胰岛素极其敏感。因此葡萄糖转运实验多应用脂肪细胞为模型，一般在体外将脂肪细胞与2-脱氧3H-葡萄糖（2-deoxy-[3H]-D-glucose）或3-0-3H-甲基葡萄糖（3-0-[3H]-methylglucose）温孵，检测放射性的衰变来反映脂肪细胞对葡萄糖的转运情况，观察待测抗糖尿病药物对葡萄糖转运的影响。另外，葡萄糖的转运实验还可应用其他的胰岛素靶器官细胞，如骨骼肌细胞。

【材料】

1．细胞取160～200g SD或Wistar雄性大鼠一只制备原代脂肪细胞或应用3T3-Ll前脂肪细胞系（本节主要介绍如何应用原代脂肪细胞进行该实验）。

2．缓冲液

(1) Hepes贮存液：Hepes[4-(2-hydroxyethyl'-piperazinethanesulfonicacid] 23.8g, NaH₂P0₄·H₂O 42g，溶于1000m1蒸馏水中，pH调至7.6 ,4℃存放2周。

(2）盐贮存液：NaCl 76.74g, KC1₃.51g, CaCl₂·2H₂0 3.63g,MgS0₄·7H₂0 3.63g，溶于1000m1蒸馏水中，4℃存放两周。

(3) 10％白蛋白贮存液：白蛋白100g，溶于500ml蒸馏水中，放置过夜后4℃透析12小时，加水至1000m1。滤纸过滤后，用0.8 um微孔滤器再次过滤。pH调至7.4，分装后-20℃存放。

(4）缓冲液：加1/lO Hepes贮存液，1/10盐贮存液，白蛋白贮存液（0.5％～5％)。

(5）细胞培养基：DMEM干粉1袋，3.7g/L NaHC0₃,1001U/ml青霉素，100 ug/ml链霉素，10％胎牛血清。

(6)胶原酶缓冲液（1.5g/L)：将胶原酶(type I）加入无血清培养基及20g/L的牛血清清蛋白配制。pH调至7.4，用0.22 um微孔滤器过滤后，分装于-20℃存放4周。

3．其他材料300 um尼龙筛；37℃水浴；电磁搅拌器；倒置显微镜；C0₂培养箱；液闪仪。

【方法】

1．原代脂肪细胞的制备

(1)大鼠用断头器或颈椎脱臼法处死后，迅速打开腹腔取附睾脂肪组织，用剪刀将其剪为约1 mm³或以下的小块，以组织两倍体积的预热的胶原酶缓冲液进行消化，37℃水浴温孵40分钟，低速搅拌1～2分钟。

(2)将网孔300 um的尼龙网折成漏斗状，置于试管上。倒入上一步骤制备好的组织消化液后用少量缓冲液缓慢冲洗。静置3～5分钟后，脂肪细胞自然上浮，收集。吸取试管底部的细胞碎片，加入lOml缓冲液后轻轻转动试管，去除下沉物。重复3～4次。

(3)合并收集的脂肪细胞悬液，用无血清的DMEM培养基洗2次。

(4)倒置显微镜下观察细胞形态，用锥虫蓝法进行细胞计数，调细胞浓度为5x10⁶/ml。于37℃ ,5％的C0₂培养箱培养。

2.葡萄糖转运的测定

(1)取脂肪细胞（2～4)x10⁶/800ul，置于培养管中于37℃水浴温孵。将胰岛素和待测药物配成不同浓度加入到上述细胞悬液中，同时设松胞素B组。温孵30～60分钟。

(2）加入2-deoxy-[3H]-D-glucose（终浓度为50 umol/L，放射强度为3.7x10⁷Bq/L)，温孵10分钟。

(3）用预冷的PBS液快速洗3次，用0.1mol/L NaOH液裂解细胞，作用2小时。将裂解液分装。

(4）取一份细胞裂解液置于闪烁瓶中，加入闪烁液，室温下过夜，第2天于液闪仪上计数每分钟衰变数（disintegrations per minute,dpm）测定其放射活性。

(5)所有数据减去相应的松胞素B组后，即得到胰岛素或不同药物刺激后特异性的葡萄糖转运量。

【结果与分析】

1．脂肪细胞形态学观察可见脂肪细胞贴壁生长，呈多角形或梭形，细胞内出现脂滴，小脂滴可融合成大脂滴。

2．脂肪细胞对胰岛素敏感，通常可将胰岛素处理组作为正常对照组，则胰岛素抵抗的脂肪细胞组或糖尿病损伤的脂肪细胞组的葡萄糖转运率明显下降，以此来比较加入不同药物后葡萄糖转运率的变化，以评价药物的作用。

3．为更准确地评价葡萄糖转运情况，可同时取一份分装的细胞裂解液测定每孔细胞的蛋白浓度，校正细胞[3H]-D-glucose的摄取量，即用每毫克蛋白每分钟的衰变数（dpm/mg protein）来反映细胞对葡萄糖的转运情况。

【注意事项】

1．本实验可应用分离制备的脂肪细胞，还可应用3T3-Ll前脂肪细胞系，但应将其诱导分化成熟，并用油红0鉴定后再进行本实验。

2．有些药物对葡萄糖的转运无直接作用，但与低浓度胰岛素（≤1 nmol/L)共同孵育，可增强胰岛素促进脂肪细胞对葡萄糖摄取作用。

3．骨骼肌细胞的葡萄糖转运实验同脂肪细胞。