血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管中膜的主要细胞成分。具有增殖、迁移、合成并释放细胞基质的能力，在血管性疾病的发生发展中有重要作用。目前已了解到血管平滑肌细胞的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成形术后再狭窄等的主要病理表现。利用体外培养血管平滑肌细胞可了解其正常和病态生物学特性及机制。

体外培养血管平滑肌细胞进行药物药理学方面的研究。体外培养血管平滑肌细胞可取材于不同动物及人胚胎或成体的不同部位的血管，根据研究目的进行选择。血管平滑肌细胞分离培养方法较多，主要有分散细胞培养法、植块培养法、微血管培养法。其中植块培养法可得到数量较多的平滑肌细胞而适用于药理研究。还可根据研究需要将分离得到的平滑肌细胞进行蜕变培养、克隆培养、与内皮细胞共培养等。

【材料】

1．动物或人胚胎血管。

2．试剂 0.1%胰蛋白酶、0.1％胶原酶,MEM培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L谷氨酰胺，10万U/L青霉素和l00mg/L链霉素）。Hanks液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS0₄·7H₂0 0.20g, KH₂P0₄ 0.06g, NaHC0₃ 0.35g，glucose 1.00g，酚磺酞0.02g)。

3．器皿及仪器细胞培养用器皿，手术器械，净化工作台、C0₂孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜等。

【方法】

1．分散细胞培养法（酶消化法）无菌术取颈或股动脉，于预冷Hanks液中洗涤3次，仔细剥除血管表面结缔组织。将血管纵向剖开移入另一装有0.1％胶原酶(D-Hanks配制）消化液的平皿中。37℃消化30分钟后，仔细剥离外膜及外层中膜并用小刀片轻轻刮除内膜，Hanks液冲洗后移入另一清洁的盛有消化酶平皿中（或剪成1 mm³组织块碎块，置离心管中）37℃消化2～3小时，不时轻晃，至组织呈絮状，收集细胞悬液并与5倍量含10％新生牛血清的培养基混合，终止消化。1000r/min离心5分钟。用含10％新生牛血清培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至5x10⁵/ml接种于培养瓶中。一般2小时开始贴壁，6～8小时可全部贴满。

2～3天换液一次，待出现致密的细胞层（1～2周）即可传代。

此法用酶消化过程中可损伤部分细胞，获得细胞量少但细胞分离彻底，较适宜进行单细胞实验研究。

2．植块培养法无菌术取目标血管（可为不同部位动脉血管），清洗干净后置于盛有培养液的平皿中，用组织镊在血管一端撕开，仔细将外膜与中膜分离。将去外膜血管纵向剖开，内膜面向上平铺于平皿中，钝性刮除内皮细胞，获得血管中膜，用培养液冲洗干净后，刀片切成1 mm3组织块，将组织块分散接种（摆放）于培养瓶中，密度1块／cm²，轻轻将培养瓶翻转（使贴组织面向上）加入培养液（不要多），置37℃ ,5% CO₂孵箱孵育，4小时左右观察组织贴壁较牢固，将培养瓶翻转，使培养液浸没组织。继续静置培养，每隔3天换液一次，培养4～7天后，细胞从组织块周边爬出，2～3周后形成致密细胞层即可传代培养。

此法分离平滑肌细胞一次收获量较大，且纯度较高，适宜进行药理学研究应用。

3．微血管平滑肌细胞培养法微血管与大血管在形态和生物学特性上有很大区别，而临床多数血管或血管相关性疾病的发生多与微血管功能变化密切相关。药理研究尤为关注脑血管、心肌血管及肿瘤血管等。以脑血管为例。

无菌条件取大鼠大脑半球，立即浸入预冷的Hanks液（含25mmol/L HEPES, pH 7.4),将组织剪碎、匀浆，用孔径210 um尼龙网过滤，将滤网连同未滤过细碎组织浸入Hanks液（含25mmol/L HEPES,pH 7.4）中轻晃尽可能将组织块脱落于液体中，将组织悬液800r/min离心5分钟，沉淀用酶消化液（含弹性酶0. 125g/L;胶原酶1;大豆胰酶抑制剂0.375g/L;CaC1₂ 0.2mmol/L; HEPES 15mmol/L；牛血清清蛋白2g/L; DMEM配制）悬浮，37℃水浴摇床培养60分钟后，吸管吹打组织悬液数次，800r/min离心5分钟，沉淀的细胞团块用培养基悬浮，分装于培养瓶中，37℃,5% C0₂培养12～18小时，轻轻吸去未贴壁细胞及细胞团块，更换新鲜培养液，当细胞形成致密层时传代培养。

4．传代培养原代培养的细胞增殖、生长汇合成片（覆盖培养瓶底70％以上，约需7-10天）即可传代。倾去培养液，Hanks液或PBS洗涤细胞3次，0.15%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液消化，倒置显微镜下观察约80％细胞有边缘收缩即加入2倍于消化液的培养液（含10％小牛血清）终止消化，吸管轻轻吹打，细胞悬液800r/min离心5分钟，弃上清液，用新培养液悬浮细胞，接种。密度以（1～5)x10⁴/ml为宜。2～3天换液一次，根据细胞生长情况（一般3～5天）再传代。

5．特殊培养在原代细胞培养成功后，可根据研究需要进行特殊培养。

(1)蜕变培养：病毒损伤血管平滑肌细胞，可能是血管性疾病的机制之一。利用此培养模型，有助于了解病毒与血管性疾病的关系及寻找干预策略。

(2）克隆培养：高度纯化目的细胞，为相关研究及应用提供材料。

(3）复合培养：将血管平滑肌细胞与内皮细胞共培养，模拟血管壁结构，为研究不同细胞间相互影响，干预因素及机制提供可能。

(4)无血清培养：制备限定因素培养的血管平滑肌细胞，使研究条件可控。

【结果与分析】

1．倒置显微镜下观察 5代以内的血管平滑肌细胞多细长呈针形，5代以上则形状增大。细胞生长汇合成片时可呈典型的梭形或长梭形，平行生长、束状排列。也可部分区域密集峰状重叠排列，另有部分区域排列稀疏，形成所谓“峰、谷”样排列，此为平滑肌细胞与成纤维细胞（同心圆状排列）的区别点之一。

2．免疫荧光标记肌宁蛋白和 a-肌动蛋白测定，此为平滑肌细胞特异性指标。

3．可用透射电镜观察细胞结构形态，确定细胞所处状态等。

【注意事项】

1.全过程需严格无菌操作。为保证细胞分离培养成功，全过程应控制在2小时内完成。

2．血管分离时尽可能将内膜和外膜分离干净，避免内皮细胞及成纤维细胞污染，保证细胞纯度。

3.胰酶溶液需用不含Ca²⁺ , Mg²⁺的D-Hanks液配制。

4．组织植块法培养操作中，组织接种时贴牢培养皿（瓶）壁是成功的关键之一，不可让其漂浮于培养基中。也可以在最初几小时不加培养基，依靠分离时组织上残留的培养基湿润和供能，这样就不需将贴面向上，避免组织坠下，接种失败。待组织贴壁较牢固后再添加培养液。