心肌细胞（myocardial cells）体外培养及建立病理模型，可直接观察药物对活细胞作用及其动态过程。并可对其作用机制进行深入研究。

据心肌细胞生物学特性，目前研究所用心肌细胞均为原代培养有限细胞系。早期研究心肌细胞采自胚胎或新生动物心脏，目前已能根据需要采用成体动物心脏。主要供体动物为小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等，亦可用犬及人胚胎。分离心肌细胞的方法有机械法及酶消化法。

【材料】

1．乳鼠心脏，SD大鼠（体重200～300g，雌雄不限。也可用豚鼠、小鼠，鸡、蛙、小型猪等）心脏或人心肌组织。

2．试剂

（1）培养液：培养基（MEM,DMEM,DMEM/F12,Ml99等）、胎牛血清。

(2)消化液：胰蛋白酶、蛋白酶XIV, I型胶原酶；低钙KH液+胶原酶I(0.5g/L)+透明质酸酶(0.3g/L)。

(3）灌流液及成分：

1）无钙KH液（mmol/L)：NaCI 118，KCl 4.7，MgS0₄ 1.2，KH₂P0₄ 1.2，NaHC0₃ 25，glu-cosel0，HEPES 10, pH 7.4。

2）低钙KH液：无钙KH液中加入0.95mmo1/L CaCl₂。

(4）其他：5-溴脱氧嘧啶核苷(5-Brdu)、碳酸氢钠液、盐酸液、0.1％苯扎溴铵。

3．仪器及器械 Langendlrff心脏灌流系统、净化工作台、C0₂孵箱、倒置显微镜、离心机、磁力搅拌器、手术器械、200目金属筛、细胞培养用器皿等。

【方法】

1．乳鼠心肌细胞培养法（未成熟心肌细胞培养法）哺乳动物心肌细胞在胚胎期具有分裂增殖能力，进行分离培养成功率高。可利用其观察正常心肌细胞功能特点、不同因素对心肌细胞结构和功能的影响。亦可将其制备成不同损伤和疾病模型，进行相应药代动力学和药效动力学的研究。

(1)乳鼠心肌细胞分离及细胞悬液制备

1)将出生2～3天SD大鼠浸入0.1％苯扎溴铵（或75％乙醇）溶液中（3～5分钟反复擦洗）消毒取出后断头，腹面向上固定于灭菌鼠板上，用碘伏消毒胸腹部皮肤，剪除胸部皮肤，充分分离皮下组织暴露视野，再用碘伏消毒胸壁。换清洁器械于剑突处胸骨左缘剪开胸壁取出心脏，置于预先装有无血清DMEM培养液平皿中。

2)换清洁手术器械剔除心脏周边血凝块、结缔组织等，去除心房，将心室转移至另一盛有无血清DMEM培养液平皿中，反复冲洗去除残留积血。

3)换洁净器械，将修整好的心室转移至盛有适量0.08％胰酶液烧杯中，剪成1 mm3碎块，转移至三角烧饼中。

4）加入剩余胰酶，轻轻吹打后置磁力搅拌器上消化（35～37℃ ,100r/minx10min)，消化完毕后再次轻轻吹打，静置2分钟待其自然沉淀后，弃去上清液，向沉淀中加入胰酶溶液重新消化（条件同上），沉淀，将上清吸出加入预冷的含15％胎牛血清的DMEM中终止消化（粗分离细胞悬液）置冰台上待用，沉淀部分重新消化，重复此步骤直至组织消化基本完全，全过程以控制在60分钟内完成为好。将各次留取的粗分离细胞悬液于冰台上过200目网筛，4℃离心（1000r/min,10分钟）DMEM（含15％胎牛血清）重悬制成细胞悬液。

(2)心肌细胞纯化：以上所获得细胞悬液中除心肌细胞外，尚有上皮细胞、成纤维细胞等，数量虽少但其生长及增殖能力均强于心肌细胞，若不排除则短时间内可大量增殖影响心肌细胞。心肌细胞的纯化可用差速贴壁法或化学试剂抑制法，国内有研究显示以两种方法联合应用效果更好。

1)差速贴壁法：根据心肌细胞贴壁较慢，而成纤维细胞贴壁快的特点，将获得的原代细胞悬液置于较大培养容器中（最好有足够底面积和深度）静置培养60～90分钟，仔细吸取培养液（富集尚未贴壁的心肌细胞）移于另一培养器皿中培养。已贴壁细胞基本为成纤维细胞，可做其他研究用。

2) 5-BrdU抑制法：5-BrdU可抑制成纤维细胞DNA合成，而对极少分化的心肌细胞影响不大，可于培养最初的24小时在培养液中加入终浓度为100umol/L的5-Brdu，抑制成纤维细胞增殖。

3)差速贴壁联合5-Brdu抑制：先以差速贴壁法两次，将所获细胞用含5 -BrdU（终浓度100umol/L）培养基培养。

(3）原代细胞接种：将纯化后的细胞悬液计数，根据不同实验目的进行稀释接种。如：拟以单细胞为研究对象，则接种细胞的密度应＜1x10⁵/ml。据研究报道，密度为5x10⁵/ml时，细胞可形成松疏的单层细胞网；密度＞1x10⁶/ml、可形成单层细胞或多层细胞，或形成细胞簇。较高的细胞密度利于心肌细胞搏动趋向同步化。培养基中加100U/ml青霉素、100 ug/ml链霉素，预防细菌污染。接种后细胞置5 % C0₂,37℃恒温培养箱中静止培养，间隔36～48小时换培养液1次，培养3～4天后使用。

(4）心肌细胞观测及鉴定：分离培养心肌细胞须经相应观测、鉴定，确定其纯度及活性方可用于实验研究。

2．成体动物心肌细胞分离培养法（成熟心肌细胞培养法）成熟动物心肌细胞在结构和功能上与未成熟动物心肌细胞在结构和功能上有很大差异，培养成熟心肌细胞并进行相应研究可了解成熟心肌细胞的生理及病理特性，对药物的药效动力学和药代动力学研究较未成熟细胞更接近临床实际。

成体心肌细胞的分离常用生物酶消化法，步骤及目的为：①正常钙浓度溶液是为了恢复心跳，排空心肌间和心腔内的残血；②无钙溶液是为了解除细胞间的横桥；③酶溶液（低钙）是为了溶解细胞外基质；④低钙溶液或保护液是为了清除组织中的消化酶，减少消化酶对心肌细胞的进一步破坏。

（1）心肌细胞分离及细胞悬液制备

1)实验准备：实验开始前所有灌流液首先氧饱和30分钟。灌流系统以37℃预热的70％乙醇灌洗15分钟、无菌去离子水清洗10分钟，在动物麻醉开始前5分钟换37℃无钙KH液循环灌流，调整流速为3 ml/min，同时用100% 0₂继续饱和。灌流液注意排空气泡。每次实验结束后用70％的乙醇和去离子水清洗系统，确保其洁净。

2）大鼠乙醚麻醉，无菌术开腹，由腔静脉注入500U/kg肝素。开胸，于主动脉近心脏出口处绕线打一活结，在其远端开一小口向心脏内插入灌流管（穿过主动脉瓣），另在右心房开口，启动灌流，将预留结扎线扎紧。将心脏与周围组织分离、取出，清理周围多余组织后与Langendliff心脏灌流系统连接，以无钙KH液非循环灌流（5 ml/min )10分钟，换酶消化液循环灌流10～12ml/min，持续15～30分钟，观察心脏扩张、泛白、柔软时停止消化。

3)由灌流装置上取下心脏，于冰冷无钙KH液中剪去心室以外组织，将心室部剪碎，37℃轻摇10分钟，200 um滤网过滤，滤液700r/min离心1分钟（有研究者实践认为不离心自然沉淀即可，离心易造成细胞损伤），弃上清液，沉淀用无钙KH液与M199以10:1,5:1,3:1,2:1,4:3混合液逐次洗涤沉降，最后换成含双抗的全M199培养基，完成复钙。纯化细胞，制成细胞悬液。

(2）原代细胞接种：将纯化后的细胞悬液计数，接种于含10％小牛血清培养基中。成体心肌细胞原代培养较未成熟心肌细胞难度大，不易贴壁，可用层黏蛋白预处理培养器皿(0.5 ug/cm2）协助贴壁。

(3）心肌细胞观测及鉴定：采用细胞形态、搏动、免疫细胞化学等方法鉴定细胞。

【结果与分析】

观察培养基色泽变化，是否澄清，细胞是否贴壁等，可大致判断培养是否成功，肌细胞生长好坏。显微镜下动态观察细胞形态、贴壁及搏动状况。

未成熟心肌细胞：倒置显微镜下可见初消化下的细胞分散、呈圆形立体状，透亮，轮廓不够清晰。培养8小时后，可见心肌细胞有聚集趋势，细胞呈延展性贴壁生长，个别可出现搏动。24小时左右，细胞明显伸展，呈多边形、梭形、不规则三角形等，大部分细胞出现搏动。48小时后，同一孔内细胞表现同步搏动。3～4天后，细胞进一步伸展，有伪足，排列松散，细胞之间能相互接触交织成网，局部形成单层细胞，同步搏动。

成熟心肌细胞：在倒置相差显微镜下观察可见到细胞呈杆状，边缘清楚，表面光滑，横纹明显，透光度好，长宽比约4～5:1(图11-18)。含钙灌流液灌注后会有部分细胞出现自律性收缩。

另可采用免疫细胞化学（测定肌动蛋白、肌球蛋白、肌联蛋白及。α-肌动蛋白等）鉴定；

MTT法测定细胞增殖率；荧光染色流式细胞仪测定细胞线粒体内膜功能等。

【注意事项】

1．严格无菌操作。

2．严格注意酶消化时间及程度。消化不足获得细胞量小，消化过度细胞状态不佳，成活率低。