在肿瘤的治疗中，化疗一直占据着不可替代的地位。联合化疗虽然对少数恶性肿瘤（如睾丸癌和儿童急性白血病）有明显的治疗效果，但在大多数恶性肿瘤中却收效不大，这其中一个很重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。肿瘤细胞耐药类型较多，一般情况下可分为原药耐药（primary drug resistance, PDR）和多药耐药（multidrug resistance,MDR)。PDR是指肿瘤细胞仅对原药产生耐药；MDR是指肿瘤细胞在化疗过程中对所用的化疗药物产生耐药的同时，对其他结构和功能不同的化疗药物也产生了交叉耐药。MDR是肿瘤化疗的最主要障碍，其形成机制非常复杂。单个耐药细胞可以同时具有多种耐药机制，而每种机制又可使肿瘤细胞对不同类型的抗肿瘤药物产生多种耐药表型。多药耐药基因mdr1及其编码的P-糖蛋白（P-gp）是目前研究较为深入的MDR机制，也被认为是MDR产生的最主要机制。其中人mdr1、小鼠mdr1a ( mdr3),mdr1b(mdr1）、仓鼠Pgp1,Pgp2与多药耐药性相关。人类的mdr1基因位于第7号染色体长臂的第2区第1带上，含有28个外显子，全长4.5 Kb。mdr1基因是人体正常细胞具有自我保护作用的基因，在人体正常组织如肾、肾上腺皮质、结肠、肝等均有一定程度的表达。这些组织的肿瘤亦有表达。在未治疗肿瘤中mdr1基因不表达或低表达，而在治疗后复发肿瘤中mdr1基因高表达的肿瘤有乳腺癌、卵巢癌、慢性淋巴细胞性白血病等。在未治疗肿瘤中mdr1偶尔高表达，在治疗后复发肿瘤中mdr1基因高表达的肿瘤有多发性骨髓癌、成神经纤维瘤、非霍奇金淋巴瘤、成年急性淋巴细胞性白血病、成年急性粒细胞性白血病等。在未治疗肿瘤中即高表达的mdr1基因的有结肠癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肾上腺皮质癌等。

P-gp是mdr1基因的表达产物，一个分子量为170Kda的膜糖蛋白。P-gp分子由1280个氨基酸残基组成，含12个疏水跨膜区和2个核酸结合位点，可与ATP结合。跨膜部分形成12个a螺旋，其氨基端和羧基端与药物结合有关，且决定了药物的特异性。P-gp引起多药耐药性的机制已得到公认：它是一种能量依赖性药物外流性膜泵，它与抗癌药结合后再与ATP结合，通过ATP供能将细胞内药物逆浓度梯度运出胞外，使细胞内药物浓度不断下降而达不到有效杀伤浓度从而产生耐药性。P-gp的耐药谱主要为天然性药物和疏水性药物如长春碱类、蒽环类和表鬼臼毒素类。这些药物的共同特点是：都具有一C-X-C-(C=0或N)的必要结构单元，可能这一结构与P-gp的药物结合位点有关。

（一）免疫组织化学方法测定P-gp的表达

通过某种酶分子标记抗体作为检测试剂，用它与固相支持物上相应抗原、抗体或抗原抗体复合物反应，形成酶抗原抗体复合物，当加入酶底物后，在复合物上将形成有色沉淀。根据沉淀深浅可在原位鉴定细胞或组织成分中抗原或抗体的量。常用的有ABC法。

【材料】

1．标本待检的肿瘤组织块冷冻切片或全血、骨髓涂片，或体外培养肿瘤细胞离心涂片。

2．试剂P一糖蛋白免疫组化染色试剂盒（可购商品试剂盒）。

【方法】

1．肿瘤组织块标本或细胞涂片自然干燥。

2．纯丙酮固定30分钟，自然干燥。

3．甲醇加H₂0₂至0.3%，室温作用30分钟，以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次，2分钟／次。

4．滴加封闭液，如正常山羊血清封闭，室温10分钟，甩去多余液体，不洗。

5．滴加抗P-gp的单克隆抗体，如JSB-1 1：100,20～37℃ 1～2小时，或4℃冰箱过夜。0.1 MPBS(pH7.2～7.4）洗3次，2分钟／次。

6．滴加二抗，如生物素化山羊抗小鼠IgG, 20～37℃ 20分钟。0.1 MPBS3次，2分钟／次。

7．滴加亲和素一生物素一过氧化物酶复合物（ABC复合物），20～37℃, 20分钟。0.1 MPBS洗4次，5分钟／次。

8．二氨基联苯胺（DAB）显色取1 ml蒸馏水，加DAB (x20）倍浓缩液、H₂0₂(x20）倍浓缩液、(x20)倍TBS浓缩缓冲液各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤。

9．苏木精轻度复染30秒，水洗。

10．连续经80%,95%,100％乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片。

【结果分析】

光学显微镜观察结果，抗原存在部位呈现棕褐色反应，细胞核蓝色。>10％细胞着色为阳性标准。

【注意事项】

1．每次洗涤后应吸干多余洗液，以免其稀释抗体。

2．每次实验要设阴、阳性对照，以掌握显色时间。

3．复染、脱水时间不宜过长。

4．为了防止造成P-gp抗原的丢失或破坏，标本离体后原则上应立即进行实验操作。用于冷冻切片的组织在离体后，应立即包埋、密封，置于液氮或干冰速冻，低温冰箱保存。冷冻切片之后需要保存，可先固定，然后PBS洗，干燥后置低温冰箱内保存，短时间内使用。

（二）间接免疫荧光法流式细胞术检测P-gp的表达

抗原与抗体复合物通过流式细胞仪时，标记在抗体或抗原上的荧光素（如FITC）在一定波长、功率的激光作用下产生荧光，根据观察比较单个细胞的荧光强度来判断细胞的耐药性。

【材料】

1．细胞体外培养的待检肿瘤细胞。

2．试剂PBS (pH7.2～7.4),1％多聚甲醛、第1抗体如JSB-1、第2抗体如荧光素FITC标记的兔抗鼠抗体。

3．用具300目尼龙网、流式细胞仪等。

【方法】

1．收集待检肿瘤细胞，1000r/min离心5分钟，用PBS洗2次。

2．室温用1％多聚甲醛固定至少30分钟。

3．立即离心（1000r/min离心5分钟），弃固定液，PBS洗3次，弃上清液。

4．用0.5ml PBS重悬细胞，用300目尼龙网过滤至干燥试管中。

5．取不少于1x10⁵／管的滤过液，加入10ul抗P-gp的单克隆抗体，如JSB-1(称第1抗体），置4℃冰箱作用1小时或过夜，设置不加1抗的对照管，称Blank管。

6. PBS离心洗1次，弃上清液。细胞沉淀加选择好的稀释度的荧光素FITC标记的兔抗鼠抗体（称第2抗体）20ul，置4℃冰箱至少30分钟。

7. PBS洗3次，细胞沉淀加500ulPBS,混匀，上流式细胞仪检测，计数5000个细胞。

【结果分析】

用Blank管调节补偿，经流式细胞仪自带的分析软件，分析得到P-gp表达的百分率。

【注意事项】

实验中应分别设置阴性和阳性对照。